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抗生物質感受性試験:2つの抗生物質のMIC値を決定し、抗生物質の相乗効果を評価するエプシロメーター試験

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抗生物質感受性は、抗生物質に対する細菌の感受性として定義され、スープ希釈試験またはエプシロメーター試験(E検定とも呼ばれる)を使用して測定することができる。

ブロス希釈法では、シリアル抗生物質希釈を含む増殖培地に標準化された数の細菌が添加される。感受性がある場合、細菌は高い抗生物質濃度で増殖することはできませんが、より低い抗生物質濃度で増殖し続け、培方が濁る原因となる。細菌がもはや生き残ることができない、または増殖できない最も低い抗生物質濃度は、与えられた細菌に対する抗生物質の最小抑制濃度、またはMICと呼ばれる。

E検定では、あらかじめ定義された抗生物質の勾配を含浸させたプラスチックストリップが、ミューラー・ヒントン寒天、またはMH-Aペトリプレート上の細菌の新たに広がった芝生の上に適用される。抗生物質は寒天媒体に拡散し、そこで細菌によって取り込かれる。感受性が高い場合、細菌は増殖することができず、死んでしまい、Eストリップの周りに明確なゾーンを形成し、成長抑制ゾーンと呼ばれる。成長がEストリップと交差する時点で、スケール上の対応する値は、抗生物質のMIC値を与える。

多くの場合、抗生物質は、細菌の抗生物質耐性株の出現を防ぐために組み合わせて使用されます。これは、多くの場合、添加剤ではなく、相乗効果をもたらします。相乗的は、2つの抗生物質の組み合わせ効果が個々の活動の合計よりも大きいことを意味する。しかし、この効果は、抗生物質の組み合わせのMIC値が少なくとも2倍減少した場合にのみ有意であると考えられる。この基準は、分数阻害濃度(FIC)インデックスを計算することによって評価されます。各抗生物質のMICのMICの比率を各抗生物質のMICと個別に組み合わせて合計することにより、0.5未満のFIC指数は相乗効果を示す。

抗生物質の相乗効果は、非クロス試験またはクロステストの2つのE検定ベースの方法を使用して測定することができる。非クロス試験では、まず、所定のMIC値を有する2つの異なる抗生物質のEストリップが2つの別々のプレートに適用される。抗生物質が培地に拡散した後、元のEストリップが除去され、代替抗生物質のEストリップが配置され、MICスケールが前のストリップのMICスケールの上に正確に置かれます。非クロステストのより速いバージョンであるクロステストでは、2つの抗生物質のEストリップが交差した形で一緒に配置され、そのMICマークのスケールが交点で90度の角度を形成します。両方の技術におけるインキュベーションに続いて、他の抗生物質と組み合わせた各抗生物質のMIC値は、成長阻害ゾーンがEストリップの縁と交差する点で読み取られます。次に、FIC インデックスが計算されます。

このビデオでは、E検定とマイクロブロス希釈試験を用いて、所定の細菌に対する特定の抗生物質のMIC値を決定する方法を示します。また、クロステストと非クロステストを使用して2つの抗生物質間の相乗効果を決定する方法を学びます。

まず、実験室用手袋やラボコートなど、適切な個人用保護具を着用してください。次に、70%エタノールを用いて作業スペースを殺菌する。次に、50%のライゼド馬の血液と20ミリリットルのβ-ニコチンアミドで無菌ミューラー・ヒントンのスープの15ミリリットルを収集します。そして、5〜8ミューラー・ヒントン寒天プレート。さて、マクファーランド濁度標準数0.5を調製するために、1%硫酸溶液の9.95ミリリットルを測定する。次に、硫酸溶液に1%塩化バリウム溶液の50マイクロリットルを添加する。溶液をよく渦にして濁液を得る。チューブをアルミホイルで覆い、脇に置きます。次に、15ミリリットルのチューブに生理食塩水の1ミリリットルを分配します。

滅菌ループを使用して、細菌試験プレートから細菌増殖のサンプルを掻き取り、ここでは、連鎖球菌群Gを使用します。その後、生理生理生理生理生理生理中に細菌を含んだループを入れ、穏やかにかき混ぜ、その後、チューブをよく渦にします。次に、細菌懸濁液とマクファーランド濁度基準を並べて配置し、濁り等価性を比較します。細菌懸濁液の濁りが標準の濁りと一致するまで、追加の生理塩分または細菌コロニーを追加します。所望の濁りが得られたら、無菌綿の先端アプリケーターを細菌の懸濁液に浸す。MH-Aプレートを接種するには、プレートの表面全体をジグザグモーションでそっと洗い、動かします。次に、プレートの底面に細菌の名前と日付をラベル付けします。

まず、ペニシリンG Eテストストリップを取り出し、鉗子で端に保持します。すり抜けたMH-Aプレートの中央にストリップをそっと置き、蓋を交換します。この例では、第2の抗生物質であるゲンタマイシンも試験される。これにより、ストリップ配置プロセスは、第2のプレートおよびゲンタマイシンE検定ストリップと共に繰り返される。E検定の結果を決定するには、ペニシリンG E検定ストリップを含む最初のプレートを収集します。次に、阻害ゾーンが抗生物質ストリップと交差する点を決定します。スケール上の対応する数値を読み取ります。この値は、ペニシリンG.のMIC値を同じ方法でゲンタマイシンのMIC値を決定する。

まず、ストレプトコッカス群G株細菌でMH-Aプレートを接種する。プレートの底部に細菌の名前、使用する抗生物質、および日付をラベル付けします。次に、関心のある抗生物質のE検定ストリップをプレートの中央に置きます。次に、2番目のテストストリップを最初のストリップに90度の角度で保持し、MICマークを見つけます。2 つの MIC 値が交差するポイントで、2 番目の E ストリップを最初の上にそっと置きます。ストリップを配置したら、それらを移動しないでください。次に、プレートを摂氏37度で18~20時間インキュベートします。

2つのMH-Aプレートを接種した後、連鎖球菌群G株細菌を用いて、1枚のプレートの表面に1つの抗生物質のE検定ストリップを置く。次に、示されるように、他の抗生物質用のE検定ストリップを第2のプレートに置く。プラスチック接種ループを使用して、それぞれのプレートの表面に各抗生物質のMIC値をマークします。次に、プレートを覆い、室温で1時間インキュベートします。この後、鉗子を使用してEストリップを取り外します。次に、プレートの1つと他の抗生物質のE検定ストリップを収集します。最初のストリップが残したインプリントの上にEテストストリップを保持し、EストリップのMIC値がマークされたラインに位置合わせするポイントを見つけます。この交差するポイントにストリップをそっと置き、配置します。2番目のプレートに対してこのプロセスを繰り返し、両方のプレートを摂氏37度で18~20時間インキュベートします。

まず、確立された細菌濃度を有する細菌懸濁液を得て、MHFブロスで培養を希釈して0.003のOD600を達成する。次に、ペニシリンGの16ミリグラムとゲンタマイシンの128ミリグラムを重量を量る。各計量乾燥抗生物質を215ミリリットルの円錐形チューブに移します。各円錐形のチューブに蒸留水の10ミリリットルを追加し、渦によってよく混合します。チューブに抗生物質の名前と濃度をラベル付けします。

三量体でアッセイを行い、96ウェルマイクロチタープレートの3列の最初のウェルに400マイクロリットルの作動細菌溶液を加える。次に、3列の井戸にMHFスープに働く細菌溶液の200マイクロリットルを追加します。さて、2倍の連続抗生物質希釈を生成するために、最初のウェルに4マイクロリットルの抗生物質ストックを加え、100倍の希釈を生成する。順次、200マイクロリットルの細菌系抗生物質溶液を各ウェルに移し、最初の井戸から2番目から2番目の行まで各行で十分に持続し、毎回の転写後に2〜3回ピペッティングして適切な混合を行う。細菌系抗生物質溶液の最終的な200マイクロリットルを廃棄します。

ペニシリンGのブロスマイクロ希釈試験の結果を決定するには、まず、濁りの欠如によって示される目に見える細菌増殖を示さないウェルを見つけます。これらの井戸から、最も低い抗生物質濃度で井戸を識別します。これは、試験された細菌に対するペニシリンGのMIC値を表す。ゲンタマイシンのMIC値は、同じアッセイおよび技術を用いて決定することができる。

非クロス試験の結果を決定するには、ペニシリンG Eストリップを含む最初のプレートを収集します。次いで、増殖抑制ゾーンが抗生物質ストリップと交差する点を決定する。スケール上の対応する値は、ゲンタマイシンと組み合わせたペニシリンGのMIC値を表す。この例では、組み合わせたMIC値は1ミリリットル当たり0.064マイクログラムです。

さて、ゲンタマイシンEストリップを含む第2のプレートを収集し、前に示したように組み合わせてMIC値を決定する。組み合わせの効果を評価するために、まず、抗生物質単独のMICでMICを組み合わせてMICを分割することにより、ペニシリンGに対する分画阻害濃度またはFICを算出する。ゲンタマイシンのこのプロセスを繰り返します。次に、ここに示す方程式を使用して FIC インデックスを計算します。組み合わせて MIC 値を 2 倍に減少すると、FIC インデックス値が 0.5 以下になり、ペニシリン G とゲンタマイシンの相乗効果が示されます。この場合、計算された FIC 値は 0.5 より大きい 1.18 です。したがって、結果は、ペニシリンGとゲンタマイシンとの間の連鎖球菌群G株に対する相乗効果を示さない。

クロステストの結果を決定するには、まず、成長阻害ゾーンがそれぞれのEストリップと交差する点を決定する。この交差点に対応する各 E 検定ストリップの数値を読み取ります。これらの値は、ペニシリンGとゲンタマイシンの組み合わせでMIC値を表す。次に、組み合わせの効果を評価するために、ここに示す式を用いてFIC指数を計算する。この例では、計算された FIC 値は 1.18 で、0.5 より大きくなります。これは、ペニシリンGおよびゲンタマイシンが連鎖球菌群G株に対して相乗的に作用しないことを意味する。

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