Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
 

Mikroskopie und Färbung: Gram, Kapsel und Endospore Färbung

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Bakterien sind mikroskopisch kleine Lebewesen, die viele Unterscheidungsmerkmale wie Form, Anordnung von Zellen, ob sie Kapseln produzieren oder nicht, und wenn sie Sporen bilden. Diese Merkmale können alle durch Färbung und Hilfe bei der Identifizierung und Klassifizierung verschiedener Bakterienarten visualisiert werden.

Um die ersten beiden Eigenschaften der Zellform und -anordnung zu untersuchen, können wir eine einfache Technik namens Gram-Färbung verwenden. Hier wird Kristallviolett auf Bakterien aufgetragen, die auf einem Dia wärmefixiert wurden. Ein Decolorizer wird dann aufgetragen und alle Bakterien mit einer dicken Peptidoglykan-Schicht färben lila, da diese Schicht nicht leicht durch den Decolorizer durchdrungen werden kann. Diese Bakterien werden als Gram positiv bezeichnet.

Gram negative Bakterien haben eine dünnere peptidoglycan Schicht und wird den Decolorizer entfärben, verlieren die lila Farbe. Sie färben jedoch rötlich-rosa, wenn ein Safranin-Zählerfleck hinzugefügt wird, der an eine Lipopolysaccharidschicht an ihrer Außenseite bindet. Einmal gebeizt, können die Zellen für Morphologie, Größe und Anordnung beobachtet werden, z. B. in Ketten oder Clustern, was bei der Klassifizierung und Identifizierung weiter hilft.

Eine weitere nützliche Technik im Toolkit des Mikrobiologen ist der Kapselfleck, der verwendet wird, um externe Kapseln zu visualisieren, die einige Arten von Bakterienzellen umgeben. Aufgrund der nicht-ionischen Zusammensetzung der Kapseln und der Tendenz, Flecken abzustoßen, funktionieren einfache Färbemethoden nicht. Stattdessen wird eine negative Färbetechnik verwendet, die zunächst den Hintergrund mit einem sauren Farbstoff, wie Kongorot, färbt, bevor die Bakterienzellen mit Kristallviolett befleckt werden. Dadurch bleibt jede Kapsel als klarer Halo um die Zellen herum vorhanden.

Die letzte große Färbetechnik, die hier behandelt wird, kann helfen festzustellen, ob die untersuchten Bakterien Sporen bilden. Unter widrigen Bedingungen produzieren einige Bakterien Endosporen, ruhende, zähe, nicht-reproduktive Strukturen, deren primäre Funktion darin besteht, das Überleben von Bakterien durch Phasen von Umweltstress wie extremen Temperaturen oder Dehydrierung zu gewährleisten. Allerdings bilden nicht alle Bakterienarten Endosporen, und sie sind schwer mit Standardtechniken zu färben, weil sie für viele Farbstoffe undurchlässig sind. Die Schaeffer-Fulton-Methode verwendet Malachit-grünfleck, der auf die an einem Dia fixierten Bakterien aufgetragen wird. Die Rutsche wird dann mit Wasser gewaschen, bevor sie mit Safranin gebeizt wird. Vegetative Zellen erscheinen rosarot, während alle vorhandenen Endosporen grün erscheinen. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie diese gängigen bakteriellen Färbetechniken durchführen und dann die Färbeproben mit Der Lichtmikroskopie untersuchen.

Um den Eingriff zu beginnen, binden Sie lange Haare zurück und ziehen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich eines Labormantels und Handschuhen.

Reinigen Sie dann ein frisches Mikroskopschlitten mit einem Labortuch. Als nächstes pipette 10 Mikroliter 1X Phosphat gepuffert Saline auf den ersten Schlitten. Verwenden Sie dann eine sterile Pipettenspitze, um eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte auszuwählen. Schmieren Sie die Bakterienkolonie in der Flüssigkeit, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu produzieren. Stellen Sie die Rutsche auf die Bankspitze, und lassen Sie es vollständig lufttrocknen.

Nach dem Trocknen, lichten Sie einen Bunsenbrenner, um die Bakterien zu erhitzen. Mit Zangen, passieren Sie die Rutsche durch die Brennerflamme mehrmals, mit den Bakterien Seite nach oben, achten Darauf, nicht die Rutsche in der Flamme zu lange zu halten, die die Zellen verzerren kann.

Nun, über das Waschbecken arbeiten, halten Sie die Rutsche Ebene und wenden Sie mehrere Tropfen von Grams Kristallviolett, um vollständig den bakteriellen Abstrich zu decken und dann legen Sie die Rutsche auf die Bank für 45 Sekunden stehen. Halten Sie als nächstes die Folie in einem Winkel, und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrom auf die Oberseite der Rutsche, wobei Sie darauf achten, den bakteriellen Abstrich nicht direkt zu spritzen. Halten Sie nun die Rutschstufe wieder auf, tragen Sie Die Jodlösung von Gram auf, um die gefärbten Bakterien vollständig zu bedecken, und lassen Sie sie dann weitere 45 Sekunden stehen. Als nächstes spülen Sie das Jod vorsichtig von der Folie, wie zuvor gezeigt. Während Sie die Folie in einem Winkel halten, fügen Sie ein paar Tropfen von Grams Decolorizer auf die Folie, so dass es über die gefärbten Bakterien herunterlaufen, nur bis der Ablauf klar ist, für etwa 5 Sekunden. Sofort mit Wasser abspülen, wie zuvor gezeigt. Dadurch wird die Überfärbung des Abstrichs begrenzt. Als nächstes, halten Sie die Rutschebene wieder, tragen Sie Grams Safranin Gegenfleck, um die gefärbten Bakterien vollständig zu bedecken. Nach 45 Sekunden den Safranin vorsichtig mit Wasser aus der Rutsche spülen und dann mit Papiertüchern trocknen.

Fügen Sie schließlich einen Tropfen Tauchöl direkt auf den Schlitten, und untersuchen Sie dann das Dia mit einem Lichtmikroskop mit einer 100-fachen Ölobjektivlinse.

Um dieses Färbeprotokoll zu beginnen, legen Sie zuerst die richtige persönliche Schutzausrüstung auf und stellen Sie dann sicher, dass die verwendeten Glasgweise sauber sind.

Erstellen Sie als Nächstes die Lösungen. Um 1% kristallviolette Lösung herzustellen, 0,25 Gramm kristallviolettes Pulver mit 25 Millilitern destilliertem Wasser und Wirbel mischen, bis es gelöst ist. Dann bereiten 1% Kongo rote Lösung durch Mischen 0,25 Gramm Kongo rotes Pulver mit 25 Milliliter destilliertem Wasser und Wirbel, bis gelöst. Nun, Pipette 10 Mikroliter der Kongo roten Lösung auf der Rutsche. Wählen Sie mit einer sauberen, sterilen Pipettenspitze eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte aus. Dann schmieren Sie die Bakterienkolonie in den Farbstoff, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu produzieren. Vollständig lufttrocknen die bakterielle Rutsche für 5-7 Minuten. Sobald die Rutsche trocken ist, überfluten Sie den Abstrich mit genügend 1% Kristallviolett, um den Abstrich zu bedecken und lassen Sie es für 1 Minute sitzen. Halten Sie nun die Rutsche in einem Winkel und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrom auf die Oberseite der Rutsche, wobei Sie darauf achten, die Bakterien nicht direkt zu spritzen. Halten Sie die Rutsche in einem 45-Grad-Winkel, bis sie vollständig luftgetrocknet ist. Fügen Sie schließlich einen Tropfen Tauchöl direkt auf die Folie, und dann untersuchen Sie das Dia mit einem Lichtmikroskop mit einem 100-fachen Ölobjektiv.

Um Endospore Färbung durchzuführen, zuerst, bereiten Sie eine 0,5% Malachit grüne Lösung durch Mischen 0. 125 Gramm Malachit-Grünpulver mit 25 Milliliter n. Wasser, und dann wirbeln die Lösung, bis gelöst. Als nächstes Pipette 10 Mikroliter 1X PBS auf die Mitte des Schlittens. Verwenden Sie dann eine sterile Pipettenspitze, um eine einzelne Bakterienkolonie aus der LB-Agarplatte auszuwählen. Schmieren Sie die Bakterien in die Flüssigkeit, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu produzieren. Stellen Sie nun die Rutsche auf die Bankspitze und lassen Sie sie vollständig lufttrocknen. Nach dem Trocknen, lichten Sie einen Bunsenbrenner, um die Bakterien zu erhitzen. Passieren Sie die Rutsche durch die blaue Brennerflamme mehrmals, mit der Bakterienseite nach oben. Dann, sobald die Folie abgekühlt ist, legen Sie ein Stück vorgeschnittenes Linsenpapier über die Hitze fest Abstrich. Als nächstes schalten Sie eine Kochplatte auf die höchste Einstellung ein und bringen Sie einen Becher Wasser zum Kochen.

Sättigen Sie das Linsenpapier mit der Malachit-grünen Lösung und legen Sie mit Einer Zange die Rutsche auf den Becher mit kochendem Wasser, um 5 Minuten zu dampfen. Halten Sie das Linsenpapier feucht, indem Sie je nach Bedarf mehr Farbstoff, einen Tropfen nach dem anderen hinzufügen. Als nächstes, wieder mit Zange, nehmen Sie die Folie aus dem Becher und entfernen und entsorgen Sie das Linsenpapier. Lassen Sie die Folie für 2 Minuten abkühlen. Wenn Sie über das Waschbecken arbeiten, halten Sie die Folie in einem Winkel und spritzen Sie vorsichtig einen Wasserstrom auf die Oberseite der Rutsche. Halten Sie nun die Folienebene und wenden Sie Safranin an, um die Folie vollständig abzudecken. Dann lassen Sie es für 1 Minute stehen. Halten Sie als Nächstes die Folie in einem Winkel und spülen Sie sie wie zuvor gezeigt. Lassen Sie die Rutsche auf der Bank oberseite trocknen. Fügen Sie schließlich einen Tropfen Tauchöl direkt auf die Folie, und dann untersuchen Sie das Dia mit einem Lichtmikroskop, mit einem 100-Fach-Ölobjektiv.

Im Gramm-Färbeprotokoll können zwei verschiedene farbige Flecken entstehen. Dunkelviolette Färbung zeigt an, dass die Bakterien grampositiv sind und dass sie den kristallvioletten Fleck beibehalten haben. Im Gegensatz dazu ist rötlich-rosa Färbung ein Merkmal von Gram-negativen Bakterien, die stattdessen durch den Safranin-Zählerfleck gefärbt werden. Zusätzlich können nach der Gram-Färbung verschiedene Formen und Anordnungen von Bakterien visualisiert werden. Zum Beispiel ist es möglich, Cocci, oder runde Bakterien, von stabförmigen Bacillus zu unterscheiden, oder Bakterien zu identifizieren, die Stränge bilden, im Vergleich zu denen, die typischerweise als Klumpen aggregieren, oder rein auftreten.

In einem Kapsel-gefärbten Mikroskopbild werden die Bakterienzellen in der Regel lila gefärbt, und der Hintergrund des Dias sollte dunkel gefärbt sein. Vor diesem dunklen Hintergrund erscheinen die Kapseln der Bakterien, wenn sie vorhanden sind, als klarer Halo um die Zellen herum.

Schließlich werden vegetative Zellen bei der Endosporenfärbung durch den Safranin-Zählerfleck rot gefärbt. Wenn Endosporen in der Probe vorhanden sind, behalten diese den malachitgrünen Fleck und erscheinen bläulich-grün in der Farbe.

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter