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Microscopie et coloration : Gram, Capsule et Staining endospore

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Les bactéries sont des organismes vivants microscopiques qui ont de nombreuses caractéristiques distinctives telles que la forme, l'arrangement des cellules, si oui ou non ils produisent des capsules, et si elles forment des spores. Ces caractéristiques peuvent toutes être visualisées par la coloration et l'aide à l'identification et à la classification de différentes espèces bactériennes.

Pour examiner les deux premières caractéristiques de la forme et de l'arrangement cellulaires, nous pouvons utiliser une technique simple appelée coloration Gram. Ici, la violette cristalline est appliquée sur les bactéries, qui ont été fixées à la chaleur sur une glissière. Un décolorateur est alors appliqué et toutes les bactéries avec une couche peptidoglycan épaisse tacheront le violet, car cette couche n'est pas facilement pénétrée par le décoloreur. Ces bactéries sont appelées Gram positive.

Gram bactéries négatives ont une couche peptidoglycan plus mince et va décolorer le décolorant, perdant la couleur pourpre. Cependant, ils tacheront le rouge-rose quand une tache de compteur de safranin e est ajoutée, qui se lie à une couche de lipopolysaccharide sur leur extérieur. Une fois tachées, les cellules peuvent être observées pour la morphologie, la taille et l'arrangement, comme dans les chaînes ou les grappes, ce qui contribue davantage à la classification et à l'identification.

Une autre technique utile dans la boîte à outils du microbiologiste est la tache de capsule, utilisée pour visualiser les capsules externes qui entourent certains types de cellules bactériennes. En raison de la composition non ionique des capsules et de la tendance à repousser les taches, les méthodes simples de coloration ne fonctionneront pas. Au lieu de cela, une technique de coloration négative est utilisée, qui tache d'abord le fond avec un colorant acide, comme le rouge du Congo, avant que les cellules bactériennes sont tachées de violette de cristal. Cela laisse n'importe quelle capsule présente comme un halo clair autour des cellules.

La dernière technique de coloration majeure couverte ici peut aider à déterminer si les bactéries étudiées forment des spores. Dans des conditions défavorables, certaines bactéries produisent des endospores, des structures dormantes, dures et non reproductrices, dont la fonction première est d'assurer la survie des bactéries par des périodes de stress environnemental, comme des températures extrêmes ou la déshydratation. Cependant, toutes les espèces bactériennes ne font pas d'endospores, et elles sont difficiles à tacher avec des techniques standard parce qu'elles sont imperméables à de nombreux colorants. La méthode Schaeffer-Fulton utilise la tache vert malachite, qui est appliquée sur les bactéries fixées à une diapositive. La glissière est ensuite lavée à l'eau avant d'être tachée de safranin. Les cellules végétatives apparaîtront rouge rosé, tandis que toutes les endospores présentes apparaîtront vertes. Dans cette vidéo, vous apprendrez à effectuer ces techniques communes de coloration bactérienne, puis examiner les échantillons de coloration à l'aide de la microscopie légère.

Pour commencer la procédure, attachez les cheveux longs et mettez l'équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants.

Ensuite, nettoyez une lame de microscope fraîche avec une lingette de laboratoire. Ensuite, pipette 10 microlitres de 1X phosphate tamponné saline sur la première diapositive. Ensuite, utilisez une pointe de pipette stérile pour sélectionner une seule colonie bactérienne de la plaque d'agar LB. Enduisez la colonie bactérienne dans le liquide pour produire une couche mince et uniforme. Fixez la glissière sur le dessus du banc et laissez-la sécher complètement.

Une fois séché, allumez un brûleur Bunsen pour réchauffer les bactéries. À l'aide de pinces, passer la glissière à travers la flamme du brûleur à plusieurs reprises, avec le côté des bactéries vers le haut, en prenant soin de ne pas tenir la glissière dans la flamme trop longtemps, ce qui peut fausser les cellules.

Maintenant, en travaillant sur l'évier, maintenez le niveau de ladiapositive et appliquez plusieurs gouttes de violette de cristal de Gram pour couvrir complètement le frottis bactérien et puis, placez la glissière sur le banc pour se tenir debout pendant 45 secondes. Ensuite, maintenez la glissière à un angle, et giclez doucement un jet d'eau sur le dessus de la glissière, en prenant soin de ne pas gicler le frottis bactérien directement. Maintenant, en maintenant le niveau de diapositive à nouveau, appliquer la solution d'iode de Gram pour couvrir complètement les bactéries tachées et puis, laissez-le reposer pendant encore 45 secondes. Ensuite, rincez soigneusement l'iode de la diapositive, comme indiqué précédemment. Tout en maintenant la glissière à un angle, ajouter quelques gouttes de décolorateur de Gram à la diapositive, lui permettant de couler sur les bactéries tachées, juste jusqu'à ce que le ruissellement est clair, pendant environ 5 secondes. Immédiatement, rincer à l'eau comme indiqué précédemment. Cela limitera la décoloration excessive du frottis. Ensuite, en maintenant le niveau de diapositive à nouveau, appliquer la contre-tache de safranine de Gram pour couvrir complètement les bactéries tachées. Après 45 secondes, rincer délicatement la safranine de la glissière avec de l'eau, comme indiqué précédemment, puis éponger avec des essuie-tout.

Enfin, ajoutez une goutte d'huile d'immersion directement à la diapositive, puis examinez la diapositive à l'aide d'un microscope léger avec une lentille objective à l'huile 100X.

Pour commencer ce protocole de coloration, d'abord mettre sur le bon équipement de protection individuelle, puis, assurez-vous que les lames de verre qui seront utilisés sont propres.

Ensuite, préparez les solutions. Pour faire 1% de violette cristalline solution, mélanger 0,25 grammes de poudre de violette cristalline avec 25 millilitres d'eau distillée, et le vortex jusqu'à dissolution. Ensuite, préparer 1% Congo solution rouge en mélangeant 0,25 grammes de poudre rouge du Congo avec 25 millilitres d'eau distillée et le vortex jusqu'à dissolution. Maintenant, pipette 10 microlitres de la solution rouge Congo sur la diapositive. À l'aide d'une pointe de pipette propre et stérile, sélectionnez une seule colonie bactérienne dans la plaque d'agar LB. Ensuite, enduire la colonie bactérienne dans le colorant pour produire une mince couche uniforme. Sécher complètement à l'air la glissière bactérienne pendant 5-7 minutes. Une fois la lame sèche, inonder le frottis avec suffisamment de 1% de violette cristalline pour couvrir le frottis et laisser s'asseoir pendant 1 minute. Maintenant, maintenez la glissière à un angle et giclez doucement un jet d'eau sur le dessus de la glissière, en prenant soin de ne pas gicler les bactéries directement. Continuer à tenir la glissière à un angle de 45 degrés jusqu'à ce qu'elle soit complètement séchée à l'air. Enfin, ajoutez une goutte d'huile d'immersion directement à la diapositive, puis examinez la diapositive à l'aide d'un microscope léger avec un objectif d'huile 100X.

Pour effectuer la coloration endospore, d'abord, préparer une solution verte malachite de 0,5% en mélangeant 0. 125 grammes de poudre verte de malachite avec 25 millilitres d'eau distillée, puis vortex la solution jusqu'à dissolution. Ensuite, pipette 10 microlitres de 1X PBS sur le centre de la diapositive. Ensuite, utilisez une pointe de pipette stérile pour sélectionner une seule colonie bactérienne de la plaque d'agar LB. Enduisez les bactéries dans le liquide pour produire une couche mince et uniforme. Maintenant, placez la glissière sur le dessus du banc, et laissez-la sécher complètement à l'air. Une fois séché, allumez un brûleur Bunsen pour réchauffer les bactéries. Passer la glissière à travers la flamme du brûleur bleu à plusieurs reprises, avec le côté des bactéries face vers le haut. Ensuite, une fois la lame refroidie, placez un morceau de papier prédécoupé sur le frottis fixe de chaleur. Ensuite, tourner sur une plaque chauffante au réglage le plus élevé, et porter un bécher d'eau à ébullition.

Saturate le papier de lentille avec la solution vert malachite et, à l'aide de pinces, placez la diapositive sur le dessus du bécher d'eau bouillante à la vapeur pendant 5 minutes. Gardez le papier de l'objectif humide en ajoutant plus de colorant, une goutte à la fois, au besoin. Ensuite, à nouveau à l'aide de pinces, ramasser la diapositive du bécher et enlever et jeter le papier de l'objectif. Laisser refroidir la lame pendant 2 minutes. En travaillant au-dessus de l'évier, tenez la glissière à un angle et giclez doucement un jet d'eau sur le dessus de la glissière. Maintenant, maintenez le niveau de diapositive et appliquez la safranine pour couvrir complètement la diapositive. Ensuite, laissez-le reposer pendant 1 minute. Ensuite, maintenez la diapositive à un angle et rincez comme indiqué précédemment. Laisser sécher la glissière à l'air sur le dessus du banc. Enfin, ajoutez une goutte d'huile d'immersion directement à la diapositive, puis examinez la diapositive avec un microscope léger, avec un objectif d'huile 100X.

Dans le protocole de coloration Gram, deux taches de couleur différentes peuvent en résulter. La coloration pourpre foncée indique que les bactéries sont Gram-positives, et qu'ils ont conservé la tache de violette de cristal. En revanche, la coloration rose-rougeâtre est une caractéristique des bactéries Gram-négatives, qui seront plutôt colorées par la tache de compteur de safranin. En outre, différentes formes et arrangements de bactéries peuvent être visualisés après la coloration Gram. Par exemple, il est possible de différencier cocci, ou bactéries rondes, de Bacillus en forme de tige, ou d'identifier les bactéries qui forment des brins, par rapport à celles qui s'agrégent généralement sous forme d'amas, ou qui se produisent individuellement.

Dans une image de microscope tachée de capsule, les cellules bactériennes seront typiquement souillées pourpre, et l'arrière-plan de la glissière devrait être sombrement souillé. Sur ce fond sombre, les capsules de la bactérie, si elles sont présentes, apparaîtront comme un halo clair autour des cellules.

Enfin, dans la coloration endospore, les cellules végétatives seront tachées de rouge par la tache de compteur de safranin. Si les endospores sont présentes dans l'échantillon, celles-ci conserveront la tache vert malachite, et apparaîtront de couleur bleu-vert.

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