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Ensayo de placa: Un método para determinar el títer viral como unidades formadoras de placas (PFU)

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Los bacteriófagos, también llamados fagos, son virus que infectan específicamente a las bacterias y podemos confirmar su presencia y cuantificarlas utilizando una herramienta llamada ensayo de placa. Los bacteriófagos infectan a sus huéspedes susceptibles uniéndose primero a la pared celular bacteriana e inyectando su material genético. Luego, secuestran la maquinaria biosintética de la célula para replicar su ADN y producir numerosas partículas de fago de progenie, que luego liberan al lysing y matar a la célula huésped.

Esta actividad lítica es la base de una técnica de enumeración de fagos ampliamente utilizada conocida como el ensayo de placa o el ensayo de doble capa de agar. Aquí, una mezcla de bacteriófagos se prepara primero en un caldo de nutrientes fundidos que contiene agar de baja concentración. Todas las bacterias utilizadas en la mezcla deben estar vivas y dividiendo activamente en la fase de registro de su crecimiento, lo que asegurará que un gran porcentaje de las bacterias son viables y capaces de formar un césped denso alrededor de las placas. A continuación, esta mezcla de agar bacteriano-faa fundido se extiende sobre un medio de nutrientes de agar concentrado más sólido que ya está solidificado en un plato de Petri. En la incubación a temperatura ambiente, el caldo de bacterias de agar-fago de baja concentración también se solidifica para formar una superposición de agar suave.

Aquí, las células bacterianas pueden derivar nutrientes adicionales de la capa inferior y deben multiplicarse rápidamente para producir un césped confluente de bacterias. Sin embargo, como las partículas de fago también están presentes en la capa blanda, estas infectarán y replicarán su material genético dentro de las bacterias, culminando en lisis celular, que libera progenie múltiple. Esta progenie de fago entonces infecta las células vecinas, ya que el estado semisólido de la capa bacteria-fago restringe su movimiento a las células huésped más distantes. Este ciclo de infección y lisis continúa a lo largo de múltiples rondas, matando a un gran número de bacterias en un área localizada. El efecto de las células vecinas que se destruyen, es producir una sola zona circular clara, llamada placa, que puede ser vista a simple vista, amplificando efectivamente la actividad lítica bacteriana del fago y permitiendo su enumeración.

El número de placas en una placa Petri se conoce como Unidades formadoras de placas, o PfUs, y, siempre que la concentración inicial de bacteriófagos fuera suficientemente diluido, debe corresponder directamente al número de partículas de fago infecciosos en la muestra original. Esta técnica también se puede utilizar para la caracterización de la morfología de la placa, para ayudar en la identificación de tipos de fagos, o para aislar a los mutantes de fagos. En este laboratorio, aprenderá a realizar el ensayo de placa para enumerar fagos, utilizando el fago T7 de E. coli como ejemplo.

En primer lugar, identificar un medio adecuado para el cultivo de las células bacterianas huésped y el bacteriófago. Aquí el caldo de lisabagenia, o medio LB, se utilizaba para cultivar E. coli y el fago T7. A continuación, tome tres botellas de vidrio limpias y etiquételas con medios, nombre, y luego la primera como LB-Broth, la segunda como Agar LB-Bottom, y la tercera como Agar LB-Top. Ahora, pesa cuatro gramos de polvo LB pre-formulado en tres conjuntos y luego transfiere un conjunto de medios secos pesados en cada botella. Añadir 200 mililitros de agua a la primera botella. Mezclar el contenido con una barra de agitación magnética.

A continuación, utilizando un medidor de pH y agitación constante, lleve el pH final a 7,4 a través de la adición de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico. Repita también la adición de agua y el ajuste del pH para las otras dos botellas restantes. Ahora, pesa tres gramos de agar en polvo y agrécalo a la segunda botella para hacer un agar inferior del 1,5 %. Finalmente, pesa 1. 2 gramos de agar y agréguelo a la tercera botella para hacer el agar superior .6 % LB. La condición del caldo en la botella uno no necesita una adición de agar. Tapar la botella de forma semi-apretada y luego, esterilizar los medios mediante el autoclave a 121 grados Celsius durante 20 minutos. Una vez completadas, retire las botellas de medios del autoclave e gire inmediatamente las tapas de las botellas para cerrarlas por completo para evitar la contaminación. Mantenga el LB-Broth y los medios de agar LB-Top en el banco para su uso posterior. Coloque el agar LB-Bottom para enfriar en un baño de agua que esté preajustado a aproximadamente 45 grados centígrados.

Cuando el agar LB-Bottom alcance aproximadamente 45 grados centígrados, transfiéralo al banco de trabajo. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con un 70 % de etenol. A continuación, añadir 450 microlitros de un cloruro de calcio molar estéril al agar inferior fundido para hacer una concentración final de 2,25 milimolares. Gire suavemente la botella para mezclarla. Luego, pon siete platos limpios de Petri. Etiquete cada plato de la parte inferior con el nombre del medio y la fecha de preparación. Luego, vierte 15 mililitros del agar inferior en cada uno de los siete platos de Petri. Deje que las placas se ajusten durante unas horas o durante la noche a temperatura ambiente. Una vez establecidas, las placas de cultivo se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante varios días si es necesario, al revés para minimizar la condensación. Transfiera los platos de Petri del refrigerador de cuatro grados Celsius a una incubadora de 37 grados Celsius una hora antes del ensayo.

El día antes de que el ensayo se preforme, el E. coli debe ser cultivado. Aquí, 10 microlitros de cultivo de E. coli se inocularon en 10 mililitros de LB-Broth. Colocar las bacterias para crecer durante la noche en una incubadora de temblores establecida a 37 grados Celsius a 160 RPM. Luego, el día del ensayo, retire el cultivo bacteriano de la incubadora. Semilla de 10 mililitros de caldo fresco LB con 0,5 mililitros del cultivo nocturno. Coloque estas células para crecer en una incubadora de temblores establecida en 37 grados Celsius a 160 RPM. A continuación, utilice un espectrofotómetro para comprobar cuándo este cultivo alcanza el crecimiento de la fase log, indicado por una densidad óptica de 0,5 a 0,7. Una vez que el OD alcanza este nivel, detenga la incubación transfiriendo el cultivo celular al banco. Ahora están listos para ser utilizados para el ensayo de superposición de fagos.

Los lanzadores de Phage pueden variar exponencialmente entre diferentes tipos de fagos y muestras. Así que con el fin de contarlos eficazmente, deben diluirse para generar una amplia gama de concentraciones de fago. El día del ensayo, generar una serie de diluciones de fago que van desde una décima a una millonésima sconcentraciones, siguiendo una técnica de dilución de 10 veces. Para obtener datos estadísticamente significativos y precisos, realice la dilución en serie en triplicado.

A continuación, derretir el agar machacante LB-top usando un microondas. A continuación, colóquelo en un baño de agua que esté preajustado a 45 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, recoja los platos De Petri que contienen la capa inferior de agar de la incubadora. Etiquete las placas con la concentración de fagos y la fecha del ensayo. A continuación, ponga siete tubos de ensayo limpios. Etiquete cada tubo de ensayo con el número de dilución de fago en serie y designe uno como control.

Cuando el agar LB-top alcance los 45 grados Centígrados, transfiéralo al banco de trabajo. Ahora, agregue 450 microlitros de un cloruro de calcio molar al agar de 200 mililitros para hacer una concentración final de 2,25 milimolares. Gire suavemente la botella para mezclarla. A continuación, agregue 35 mililitros de agar LB-top y cuatro mililitros de suspensión bacteriana a un tubo cónico estéril. Gire suavemente para distribuir uniformemente las células, pero evite agitar para evitar la formación de espuma.

Ahora, alícuota cinco mililitros de esta mezcla de agar superior de bacterias a cada uno de los siete tubos de ensayo. A continuación, transfiera 100 microlitros de las muestras de bacteriófagos diluidos en serie y los medios de control, que deben ser simplemente medios sin bacteriófagos, a los tubos de ensayo etiquetados respetuosamente. Gire suavemente la mezcla para asegurar una mezcla adecuada. Transfiera suavemente cinco mililitros de mezcla de bacteriófagos a la placa Petri respectiva. Extienda uniformemente la mezcla por toda la superficie girando suavemente la placa Petri.

Una vez que todas las placas Petri están en capas con la mezcla, permitir la solidificación de la capa superior mediante la incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de completar estos pasos, repita el proceso para el segundo y luego el tercer conjunto de los platos Petri utilizando los dos conjuntos restantes de diluciones de fago. Selle cada plato con parafilm e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Coloque la placa de cultivo boca abajo a una temperatura adecuada durante 24 horas o hasta que se desarrollen las placas. Aquí, las placas se colocaron en una incubadora de 37 grados Celsius por un día, una condición de crecimiento estimulante para E. coli y el fago T7.

Las placas aparecerán después de uno a cinco días de incubación, dependiendo de las especies bacterianas, las condiciones de incubación y la elección del medio. Aquí, las placas eran visibles después de un día de incubación a 37 grados centígrados. Comience por comprobar las placas marcadas control y asegúrese de que no se formaron placas en estas placas, ya que esto indicaría contaminación viral. Para determinar el título de fago en la muestra original, comience con las placas que contienen la muestra de fago más diluida primero y cuente las placas sin quitar las tapas, marcándolas para indicar cuáles ya se han contado. Repita el conteo para cada plato en cada juego. Algunas placas pueden tener demasiadas o muy pocas placas para ser contadas. Considere de 10 a 150 como un recuento de placas ideal.

A continuación, genere una tabla que muestre los valores de número de placa para las diferentes diluciones y réplicas. A continuación, calcule los valores del número medio de placa para las placas de dilución que contenían el número ideal de recuentos de placas. En este ejemplo, estos fueron el número promedio de placas formadas en el 10 a los menos tres y 10 a las menos cuatro placas de dilución. Ahora, ajuste el factor de dilución del fago dividiendo los valores medios de placa obtenidos por los factores de dilución del fago respectivos. Aquí, el número promedio de placas formadas a la 10 a la menos tres y 10 a las menos cuatro placas de dilución, se dividieron por sus respectivos factores de dilución para obtener el número de unidades formadoras de placas, o PFUs, en 100 microlitros de mezcla de fago. Para convertir el valor a PFU por mililitro, multiplique los valores generados por 10, ya que sólo se utilizaron 100 microlitros de mezcla de dilución de fago durante el paso de preparación de la superposición de bacteriófagos, produciendo un factor de dilución adicional de 10. Por último, calcular el promedio de los valores obtenidos a partir de las diferentes placas de dilución. Esto dará el número promedio de PFUs por mililitro. El número de PPU corresponde al número de partículas de fago infecciosos en la muestra original.

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