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Test de la plaque : méthode de détermination de la charge virale exprimée en unités formant des plaques

Overview

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Département des sciences cliniques Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Suède

Les virus qui infectent les organismes procaryotes, appelés bactériophages ou simplement phages, ont été identifiés au début duXXe siècle par Twort (1) et d'Hérelle (2) indépendamment. Les phages ont depuis été largement reconnus pour leur valeur thérapeutique (3) et leur influence sur les écosystèmes humains (4), ainsi que sur les écosystèmes mondiaux (5). Les préoccupations actuelles ont alimenté un regain d'intérêt pour l'utilisation des phages comme alternative aux antibiotiques modernes dans le traitement des maladies infectieuses (6). Essentiellement, toutes les recherches sur les phages reposent sur la capacité de purifier et de quantifier les virus, également connu sous le nom de titre viral. Initialement décrit en 1952, c'était le but de l'assiduité de la plaque (7). Des décennies et de multiples progrès technologiques plus tard, l'analyse de la plaque demeure l'une des méthodes les plus fiables pour la détermination du titre viral (8).

Les bactériophages subsisent en injectant leur matériel génétique dans les cellules hôtes, en détournant les machines pour la production de nouvelles particules de phage, et finalement en provoquant l'hôte de libérer de nombreuses virions progéniture par lyse cellulaire. En raison de leur taille infime, les bactériophages ne peuvent pas être observés à l'aide uniquement de microscopie légère; par conséquent, la microscopie électronique de balayage est nécessaire (figure 1). En outre, les phages ne peuvent pas être cultivés sur les plaques d'agar nutritionnelles comme les bactéries, car ils ont besoin de cellules hôtes pour s'en prendre à eux.

Figure 1
Figure 1 : La morphologie d'un bactériophage, ici illustrée par un phage E. coli, peut être étudiée à l'aide de la microscopie électronique à balayage. La plupart des bactériophages appartiennent aux Caudovirales (bactériophages à queue). Ce phage particulier a une structure de queue très courte et une tête icosaèdre, le plaçant dans la famille des Podovirus.

L'essai de plaque (figure 2) est basé sur l'incorporation des cellules hôtes, préférentiellement dans la croissance de phase de journal, dans le milieu. Cela crée une couche dense et turbide de bactéries capables de soutenir la croissance virale. Un phage isolé peut ensuite infecter, se répliquer et lyser une cellule. Avec chaque cellule lysée, plusieurs cellules adjacentes deviennent immédiatement infectées. Plusieurs cycles dans, une zone claire (une plaque) peut être observée dans la plaque autrement turbide (figure 2B/figure 3A), indiquant la présence de ce qui était initialement une particule bactériophage unique. Le nombre d'unités de formation de plaques par volume(c.-à-d. PFU/mL) d'un échantillon, peut donc être déterminé à partir du nombre de plaques générées.

Figure 2
Figure 2 : Le dépistage des unités de formation de plaque (PFU) est une méthode courante pour déterminer le nombre de bactériophages dans un échantillon. (A) La base d'un plat stérile Petri est recouverte d'un milieu nutritif solide approprié, suivie d'un mélange de milieux mous, de cellules hôtes sensibles et d'une dilution de l'échantillon de bactériophage d'origine. Notez que la suspension de phage pourrait, dans certains cas, également être répartie uniformément sur la surface de l'agar mou déjà solidifié. (B) La croissance des bactéries hôtes forme une pelouse de cellules dans la couche supérieure d'agar. La réplication des bactériophages génère des zones claires, ou plaques, causées par la lyse des cellules hôtes.

Figure 3
Figure 3 : Les résultats des tests PFU montrent plusieurs plaques générées par des bactériophages. En raison de la lyse des cellules hôtes sensibles, les plaques peuvent être considérées comme des zones de dégagement dans la pelouse bactérienne, soit avec (A) dégagement complet, soit (B) re-croissance partielle causée par la génération de bactéries résistantes (ou peut-être par des phages tempérés dans le cycle lysogénique).

Certains phages tempérés peuvent adopter ce qu'on appelle un cycle de vie lysogénique, en plus de la croissance lytique précédemment décrite. En lysogénie, le virus assume un état latent par l'incorporation de son matériel génétique dans le génome de la cellule hôte (9), conférant souvent une résistance à d'autres infections phages. Cela se révèle parfois par un léger obscurcissement de la plaque (figure 3B). Il est intéressant de noter cependant, que les plaques peuvent également apparaître floues en raison de la repousse des bactéries qui ont évolué résistance au phage indépendamment des infections phage précédente.

Les virus peuvent se fixer, ou adsorb, à seulement une gamme limitée de bactéries hôtes (10). Les plages d'hôtes sont encore limitées par des stratégies antivirales intracellulaires telles que le système CRISPR-Cas (11). La résistance/sensibilité à l'égard de phages spécifiques affichés par les sous-groupes bactériens a toujours été utilisée pour classer les souches bactériennes en différents types de phages (figure 4). Bien que l'efficacité de cette méthode ait maintenant été surpassée par de nouvelles techniques de séquençage, la dactylographie peut encore fournir des informations précieuses sur les interactions bactéries-phage, par exemple, en facilitant la conception d'un cocktail de phage pour une utilisation clinique .

Figure 4
Figure 4 : Sensibilité aux phages de différentes souches bactériennes. Des plaques d'agar molles avec la souche d'acné de Cutibacterium (A) AD27 et (B) AD35, ont été repérées avec 21 bactériophages différents de C. acnes. Seul phage 11 a été en mesure d'infecter et de tuer AD27 tandis que la souche AD35 a montré une sensibilité envers tous les phages. Cette technique, appelée dactylographie phage, peut être utilisée pour diviser les espèces bactériennes et les souches en différents sous-groupes basés sur la susceptibilité au phage.

Procedure

1. Mise en place

  1. Avant de commencer tout travail impliquant des microbes, assurez-vous que l'espace de travail est stérilisé(p. ex. essuyé avec 70 % d'éthanol). Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants, gardez les cheveux longs attachés en arrière et assurez-vous que les plaies sont particulièrement bien protégées.
  2. Une fois terminé, stériliser toutes les surfaces et bien laver /stériliser les mains et les poignets.

2. Protocole

  1. Préparation de LB Media
    Note: Selon la souche bactérienne hôte et le bactériophage, un milieu liquide différent peut être plus approprié pour la culture initiale de la souche bactérienne hôte ou un milieu solide différent peut être plus approprié pour la croissance ultérieure. Le bouillon de lysogénie (LB) est utilisé dans ce protocole pour le bouillon et l'agar.
    1. Mélanger 4 g LB dans de l'eau distillée de 200 ml, en triplicate, pour le bouillon LB, l'agar solide en fond et l'agar doux. Toutes les solutions doivent être préparées dans des conteneurs capables de contenir deux fois le volume final pour éviter les débordements pendant l'autoclacage.
      Note: Si vous effectuez l'assay en triple, préparez le double de la quantité d'agar de fond LB.
    2. Ajustez le pH des trois solutions à 7.4 en utilisant NaOH ou HCl le cas échéant.
    3. Ajouter 3 g de puissance d'agar à la bouteille d'agar inférieure pour faire une solution d'agar de 1,5% pour l'agar solide
    4. Ajoutez 1,2 g de puissance d'agar à la bouteille d'agar supérieure pour faire une solution d'agar de 0,6 % pour l'agar doux.
    5. Placer les bouteilles, avec des bouchons semi-serrés, dans un autoclave réglé à 121 oC pendant 20 min pour stériliser les solutions. Fermez les bouchons dès que la course est terminée pour éviter la contamination.
    6. Lorsque le support LB a atteint une température d'environ 45-50 oC, ajouter 450 l de stérile 1 M CaCl2 aux trois solutions lb de 200 ml pour faire une concentration finale de 2,25 mM.
    7. Verser 15 ml d'aliquots du milieu d'agar solide dans des plats petri stériles (éviter de secouer pour éviter l'écume) et laisser l'agar se solidifier pendant quelques heures ou toute la nuit à température ambiante (figure 4A). Les plaques peuvent être stockées à l'envers à 4 oC pendant plusieurs jours.
  2. Cultiver des cellules hôtes
    1. Un jour avant l'assiduité, ajouter 10 l de culture E. coli à 10 ml de bouillon LB.
    2. Incuber la bactérie à 37oC pendant la nuit à 160 tr/min dans un incubateur secouant.
    3. Le matin de l'astodonte, ajouter 0,5 ml de la culture de nuit à 10 ml de LB frais.
      Note: Si vous effectuez l'assay en triple, préparez le double de cette culture.
    4. Incuber le 37oC à 160 tr/min dans un incubateur secouant jusqu'à ce que la culture bactérienne soit en phase de croissance. Cela peut être déterminé spectrophotométriquement par un OD600 de 0,5-0,7.
    5. Gardez la culture à température ambiante jusqu'à ce que les bactéries soient ajoutées à l'agar LB supérieur.
  3. 10 fois dilution en série du bactériophage
    1. Ajouter 180 l de bouillon LB à sept puits dans la première rangée d'une assiette de 96 puits
      Note: Il est suggéré d'effectuer la dilution en triplicate afin d'augmenter sa fiabilité statistique. Pour ce faire, préparer des dilutions supplémentaires du bactériophage dans les deuxième et troisième rangées de la plaque.
    2. Vortex soigneusement l'échantillon de bactériophage d'origine pour assurer l'homogénéité et transférer 20 L dans le premier puits.
    3. Bien mélanger l'échantillon par pipetting et vers le bas.
    4. Transférer 20 ll de la suspension résultante dans le deuxième puits.
    5. Continuer la dilution en série en transférant 20 l l de la solution dans le second puits dans le troisième puits, et ainsi de suite, jusqu'à ce que le sixième puits, laissant le septième bien comme un contrôle négatif à laquelle aucune suspension de phage ne sera ajouté. Cela créera une plage de dilution de 10-1-10-6.
  4. Placage
    1. Étiquetez la base des plats Petri (précédemment préparés à l'étape 2.1.7) avec le nom, la date et une courte description de l'échantillon (y compris le facteur de dilution de l'échantillon de phage). Préchauffer les plats Petri dans un incubateur à 37oC une heure avant l'assidu.
    2. Faire fondre le milieu d'agar mou solidifié (généralement fait à l'aide d'un four à micro-ondes; l'agar solidifié fond à 85 oC), et laisser venir à environ 45 oC. Les supports chauffés peuvent être placés dans un bain d'eau de 45 oC pendant 1h pour atteindre une température appropriée. Il doit être assez chaud pour rester sous forme liquide, mais assez frais pour ne pas tuer les bactéries ajoutées.
    3. Mélanger la culture bactérienne de 4 ml (à partir de l'étape 2,2) avec une gélose molle de 35 ml lb (à 45 oC). Tourbillonner pour répartir uniformément les cellules, mais éviter de secouer pour éviter l'écume (Figure 4A).
    4. Étiquetez un tube à essai stérile pour chacune des étapes de dilution en série et un pour l'échantillon témoin, pour un total de 7 tubes à essai étiquetés. Placer 5 mL d'aliquots de la culture bactérienne/mélange d'agar doux de l'étape 2.4.3 dans les 7 tubes. Travaillez rapidement à l'étape 2.4.6 parce que ces petits volumes de supports à base d'agar se solidifieront rapidement à température ambiante.
    5. Ajouter 100 l de l'échantillon témoin (à partir de l'étape 2.3) au tube d'essai de commande et tourbillonner soigneusement. Jetez la pointe de pipette usagée et transférez le même volume de chacun des échantillons de bactériophage dilués en série (étape 2.3) à leurs tubes à essai respectifs, tourbillonnant pour mélanger.
    6. Transférer immédiatement les mélanges de 5 ml sur les plaques d'agar étiquetées, préchauffées et solides (Figure 4A). Faites tourbillonner doucement les assiettes pour même étendre les mélanges.
      Note: Si vous effectuez l'assay en triple, répétez deux fois de plus les étapes 2.4.3-6 deux fois de plus.
    7. Sceller chaque plaque avec du film de laboratoire et laisser les deux couches se solidifier correctement à température ambiante (environ 15 minutes) avant de les placer vers le bas d'un incubateur de 37 oC, stimulant la croissance des bactéries et du phage, pendant 24 heures ou jusqu'à ce que les plaques développer, Il faut généralement environ 1-5 jours pour les plaques à apparaître (Figure 4B), mais le calendrier varie considérablement en fonction des conditions d'incubation, moyen, et les espèces bactériennes.

3. Analyse des données et résultats

  1. Compter les plaques
    1. Assurez-vous qu'aucune plaque n'est visible dans les plaques marquées « contrôle », car cela indiquerait une contamination virale.
    2. Commencez par les plaques étiquetées 10-6, contenant l'échantillon de bactériophage le plus dilué. Comptez les plaques sans enlever le couvercle, en les marquant avec un stylo que vous allez pour indiquer quelles plaques ont déjà été comptés.
    3. Comptez les plaques restantes. Certaines plaques peuvent avoir trop peu ou trop de plaques à compter. Utilisez les plaques avec 10-150 plaques pour une analyse plus approfondie.
  2. Calcul de l'UF
    1. Diviser le nombre de plaques par le facteur de dilution (ex. 10-6 pour l'échantillon le plus dilué) pour obtenir le nombre d'unités de formation de plaque (PFU) dans 100 l de mélange de phage.
      Note: Si vous effectuez le récarthèse en triple, utilisez le nombre moyen de plaques des trois plaques.
    2. Pour déterminer la concentration (dans l'UL/mL) de l'échantillon original, multipliez par un facteur de dilution supplémentaire de 10, puisque seulement 100 l'échantillon a été plaqué. (c'est à dire )
    3. Calculez la valeur moyenne du PFU/mL pour toutes les dilutions qui avaient entre 10 et 150 plaques pour atteindre un résultat plus fiable.

Les bactériophages, aussi appelés phages, sont des virus qui infectent spécifiquement les bactéries et nous pouvons confirmer leur présence et les quantifier à l'aide d'un outil appelé l'essai de plaque. Les bactériophages infectent leurs hôtes sensibles en se fixant d'abord à la paroi cellulaire bactérienne et en injectant leur matériel génétique. Ensuite, ils détournent la machinerie biosynthétique de la cellule pour reproduire leur ADN et produire de nombreuses particules de phage progéniture, qu'ils libèrent ensuite en lysing et en tuant la cellule hôte.

Cette activité lytique est la base d'une technique d'énumération de phage largement utilisée connue sous le nom d'essai de plaque ou d'essai de double couche d'agar. Ici, un mélange de bactériophage est d'abord préparé dans un bouillon nutritif fondu contenant de l'agar à faible concentration. Toutes les bactéries utilisées dans le mélange doivent être vivantes et se diviser activement dans la phase de notation de leur croissance, ce qui permettra de s'assurer qu'un grand pourcentage des bactéries sont viables et capables de former une pelouse dense autour des plaques. Ensuite, ce mélange d'agar de la génale bactérienne-phage fondu est réparti sur un milieu nutritif d'agar plus solide et concentré qui est déjà solidifié sur un plat De Petri. Lors de l'incubation à température ambiante, le bouillon à faible concentration d'agar-phage-bactéries se solidifie également pour former une superpose d'agar molle.

Ici, les cellules bactériennes peuvent tirer des éléments nutritifs supplémentaires de la couche inférieure et devraient se multiplier rapidement pour produire une pelouse confluente de bactéries. Cependant, comme les particules de phage sont également présentes dans la couche molle, celles-ci infecteront et reproduiront leur matériel génétique au sein de la bactérie, aboutissant à la lyse cellulaire, qui libère plusieurs descendants. Ces descendants de phage infectent alors les cellules voisines, car l'état semi-solide de la couche de bactéries-phage limite leur mouvement aux cellules hôtes plus éloignées. Ce cycle d'infection et de lyse se poursuit sur plusieurs cycles, tuant un grand nombre de bactéries dans une zone localisée. L'effet des cellules voisines étant détruites, est de produire une zone claire circulaire unique, appelée une plaque, qui peut être vu à l'œil nu, amplifiant efficacement l'activité lytique des bactéries du phage et permettant leur énumération.

Le nombre de plaques sur un plat Petri sont appelés unités de formation de plaque, ou PFUs, et, à condition que la concentration initiale de bactériophage était suffisamment diluée, devrait correspondre directement au nombre de particules de phage infectieux dans l'échantillon original. Cette technique peut également être utilisée pour la caractérisation de la morphologie de la plaque, pour aider à l'identification des types de phages, ou pour isoler les mutants phages. Dans ce laboratoire, vous apprendrez à effectuer l'exemple de l'épispourration des phages, en utilisant le phage T7 de E. coli.

Tout d'abord, identifier un milieu approprié pour la culture des cellules bactériennes hôtes et le bactériophage. Ici, le bouillon de lysogénie, ou médium LB, a été utilisé pour la culture E. coli et le phage T7. Ensuite, prenez trois bouteilles en verre propre et les étiqueter avec des médias, le nom, puis le premier comme LB-Broth, le second comme LB-Bottom Agar, et le troisième comme LB-Top Agar. Maintenant, peser quatre grammes de poudre PRÉ-formulée LB en trois ensembles, puis transférer un ensemble de supports séchés pesés dans chaque bouteille. Ajouter 200 millilitres d'eau à la première bouteille. Mélanger le contenu à l'aide d'une barre magnétique.

Puis, à l'aide d'un pH mètre et en remuant constamment, porter le pH final à 7,4 grâce à l'ajout d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique. Répétez l'ajout d'eau et l'ajustement du pH pour les deux autres bouteilles restantes, ainsi. Maintenant, peser trois grammes de poudre d'agar et l'ajouter à la deuxième bouteille pour faire une agar de 1,5 % de fond. Enfin, peser 1. 2 grammes d'agar et l'ajouter à la troisième bouteille pour faire l'agar haut de 0,6 % LB. L'état de bouillon dans la bouteille on n'a pas besoin d'un ajout d'agar. Capuchon de la bouteille semi-serré, puis, stériliser les médias en autoclant à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois terminés, retirer les bouteilles de l'autoclave et rordre immédiatement les bouchons de bouteille pour les fermer complètement afin d'éviter la contamination. Gardez les médias LB-Broth et LB-Top Agar sur le banc pour une utilisation ultérieure. Placez l'agar LB-Bottom pour refroidir dans un bain d'eau qui est préréglé à environ 45 degrés Celsius.

Lorsque l'agar LB-Bottom atteint environ 45 degrés Celsius, transférez-la sur le banc de travail. Ensuite, stériliser l'espace de travail à l'aide de 70 % d'éthénol. Ensuite, ajoutez 450 microlitres de chlorure de calcium stérile d'une molaire à la gélose du fond fondu pour faire une concentration finale de 2,25 millimolar. Faites tourbillonner doucement la bouteille pour mélanger. Ensuite, mettre en place sept plats Petri propres. Étiquetez chaque plat sur le fond avec le nom du média et la date de préparation. Ensuite, versez 15 millilitres de la gélose inférieure dans chacun des sept plats Petri. Laisser les assiettes reposer pendant quelques heures ou toute la nuit à température ambiante. Une fois fixées, les plaques de culture peuvent être stockées à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours si nécessaire, à l'envers pour minimiser la condensation. Transférer les plats Petri du réfrigérateur de 4 degrés Celsius dans un incubateur de 37 degrés Celsius une heure avant l'assidu.

La veille de l'assiduité, la bactérie E. coli doit être cultivée. Ici, 10 microlitres de la culture E. coli ont été inoculés en 10 millilitres de LB-Broth. Placez les bactéries à croître pendant la nuit dans un incubateur secouant réglé à 37 degrés Celsius à 160 tr/min. Puis, le jour de l'assidu, retirer la culture bactérienne de l'incubateur. Ensemencer un frais 10 millilitres de bouillon LB frais avec 0,5 millilitres de la culture du jour au lendemain. Placez ces cellules pour se développer dans un incubateur secouant réglé à 37 degrés Celsius à 160 rPM. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre pour vérifier quand cette culture atteint la croissance de la phase de journal, indiquée par une densité optique de 0,5 à 0,7. Une fois que l'OD atteint ce niveau, arrêter l'incubation en transférant la culture cellulaire sur le banc. Ils sont maintenant prêts à être utilisés pour l'assougage de la pariation de phage.

Les titers de phage peuvent varier exponentiellement selon les types de phages et les échantillons. Ainsi, afin de les compter efficacement, ils doivent être dilués pour générer un large éventail de concentrations de phages. Le jour de l'assidu, générer une série de dilutions phage allant d'un dixième à un millionième de concentrations, suivant une technique de dilution 10 fois. Pour obtenir des données statistiquement significatives et précises, effectuez la dilution en série en triple.

Ensuite, faire fondre l'agar SOLIDifié LB-dessus à l'aide d'un four à micro-ondes. Ensuite, placez-le dans un bain d'eau qui est préréglé à 45 degrés Celsius pendant une heure. Après une heure, recueillir les plats Petri contenant la couche inférieure d'agar de l'incubateur. Étiqueter les plaques avec une concentration de phage et une date d'assidu. Ensuite, mettre en place sept tubes à essai propres. Étiquetez chaque tube à essai avec le numéro de dilution de phage en série et désignez-en un comme contrôle.

Lorsque l'agar LB-dessus atteint 45 degrés Celsius, le transférer sur le banc de travail. Maintenant, ajoutez 450 microlitres d'un chlorure de calcium molaire à l'agar de 200 millilitres pour faire une concentration finale de 2,25 millimolar. Faites tourbillonner doucement la bouteille pour mélanger. Ensuite, ajoutez 35 millilitres d'agar LB-top et quatre millilitres de suspension bactérienne à un tube conique stérile. Tourbillonner doucement pour répartir uniformément les cellules, mais éviter de secouer pour éviter l'écume.

Maintenant, aliquot cinq millilitres de cette bactérie-top mélange d'agar à chacun des sept tubes à essai. Ensuite, transférez 100 microlitres des échantillons de bactériophage dilués en série et contrôlez les supports, qui devraient être simplement des médias sans bactériophage, vers les tubes à essai étiquetés respectueusement. Faire tourbillonner doucement le mélange pour assurer un bon mélange. Transférer délicatement cinq millilitres de mélange bactériophage sur la plaque Petri respective. Étendre uniformément le mélange sur toute la surface en faisant tourbillonner doucement la plaque Petri.

Une fois que toutes les plaques Petri sont superposées avec le mélange, permettre la solidification de la couche supérieure en couve à température ambiante pendant 15 minutes. Après l'achèvement de ces étapes, répéter le processus pour la deuxième, puis les troisièmes ensembles de la vaisselle Petri en utilisant les deux autres ensembles de dilutions phage. Sceller chaque plat avec du parafilm et couver à température ambiante pendant 15 minutes. Placez la plaque de culture à l'envers à une température appropriée pendant 24 heures ou jusqu'à ce que les plaques se développent. Ici, des plaques ont été placées dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant une journée, un état de croissance stimulant pour E. coli et le phage T7.

Les plaques apparaîtront après un à cinq jours d'incubation, selon les espèces bactériennes, les conditions d'incubation et le choix du milieu. Ici, les plaques étaient visibles après une journée d'incubation à 37 degrés Celsius. Commencez par vérifier les plaques marquées de contrôle et assurez-vous qu'aucune plaque n'a été formée dans ces plaques, car cela indiquerait une contamination virale. Pour déterminer le téter phage dans l'échantillon d'origine, commencez par les plaques contenant l'échantillon de phage le plus dilué en premier et comptez les plaques sans enlever les couvercles, en les marquant pour indiquer lesquelles ont déjà été comptées. Répétez le comptage pour chaque assiette dans chaque ensemble. Certaines plaques peuvent avoir trop ou trop peu de plaques à compter. Considérez 10 à 150 comme un nombre idéal de plaque.

Ensuite, générer un tableau énumérant les valeurs du nombre de plaque pour les différentes dilutions et répliques. Ensuite, calculez les valeurs moyennes du nombre de plaques pour les plaques de dilution qui contenaient le nombre idéal de numérations de plaques. Dans cet exemple, il s'agissait du nombre moyen de plaques formées dans les plaques 10 à moins trois et 10 aux plaques de dilution moins quatre. Maintenant, ajustez pour le facteur de dilution de phage en divisant les valeurs moyennes obtenues de plaque par les facteurs respectifs de dilution de phage. Ici, le nombre moyen de plaques formées à la 10 à la moins trois et 10 à la moins quatre plaques de dilution, ont été divisés par leurs facteurs de dilution respectifs pour obtenir le nombre d'unités de formation de plaque, ou PFUs, dans 100 microlitres de mélange de phage. Pour convertir la valeur en PFU par millilitre, multipliez les valeurs générées par 10, car seulement 100 microlitres de mélange de dilution de phage ont été utilisés pendant l'étape de préparation de la superpose bactériophage, produisant un facteur de dilution supplémentaire de 10. Enfin, calculez la moyenne des valeurs obtenues à partir des différentes plaques de dilution. Cela donnera le nombre moyen de PFUs par millilitre. Le nombre de PFU correspond au nombre de particules de phage infectieux dans l'échantillon d'origine.

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Applications and Summary

Malgré les multiples progrès technologiques, les essais de plaque demeurent l'étalon-or pour la détermination du titre viral (comme PFU) et essentiels à l'isolement des populations de bactériophages purs. Les cellules hôtes sensibles sont cultivées dans la couche supérieure d'une plaque d'agar à deux couches, formant un lit homogène permettant une réplication virale. L'événement initial où un bactériophage isolé dans le cycle de vie lytique infecte une cellule, se reproduit à l'intérieur, et éventuellement la lyse, est trop petit pour l'observer. Cependant, les virions libérées infecteront les cellules adjacentes, donnant par la suite lieu à une zone de dégagement, ou plaque, dénotant la présence d'un seul PFU.

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References

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