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Application de la plaque : Méthode pour déterminer le titer viral en tant qu'unités de formation de plaque (PFU)

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Les bactériophages, aussi appelés phages, sont des virus qui infectent spécifiquement les bactéries et nous pouvons confirmer leur présence et les quantifier à l'aide d'un outil appelé l'essai de plaque. Les bactériophages infectent leurs hôtes sensibles en se fixant d'abord à la paroi cellulaire bactérienne et en injectant leur matériel génétique. Ensuite, ils détournent la machinerie biosynthétique de la cellule pour reproduire leur ADN et produire de nombreuses particules de phage progéniture, qu'ils libèrent ensuite en lysing et en tuant la cellule hôte.

Cette activité lytique est la base d'une technique d'énumération de phage largement utilisée connue sous le nom d'essai de plaque ou d'essai de double couche d'agar. Ici, un mélange de bactériophage est d'abord préparé dans un bouillon nutritif fondu contenant de l'agar à faible concentration. Toutes les bactéries utilisées dans le mélange doivent être vivantes et se diviser activement dans la phase de notation de leur croissance, ce qui permettra de s'assurer qu'un grand pourcentage des bactéries sont viables et capables de former une pelouse dense autour des plaques. Ensuite, ce mélange d'agar de la génale bactérienne-phage fondu est réparti sur un milieu nutritif d'agar plus solide et concentré qui est déjà solidifié sur un plat De Petri. Lors de l'incubation à température ambiante, le bouillon à faible concentration d'agar-phage-bactéries se solidifie également pour former une superpose d'agar molle.

Ici, les cellules bactériennes peuvent tirer des éléments nutritifs supplémentaires de la couche inférieure et devraient se multiplier rapidement pour produire une pelouse confluente de bactéries. Cependant, comme les particules de phage sont également présentes dans la couche molle, celles-ci infecteront et reproduiront leur matériel génétique au sein de la bactérie, aboutissant à la lyse cellulaire, qui libère plusieurs descendants. Ces descendants de phage infectent alors les cellules voisines, car l'état semi-solide de la couche de bactéries-phage limite leur mouvement aux cellules hôtes plus éloignées. Ce cycle d'infection et de lyse se poursuit sur plusieurs cycles, tuant un grand nombre de bactéries dans une zone localisée. L'effet des cellules voisines étant détruites, est de produire une zone claire circulaire unique, appelée une plaque, qui peut être vu à l'œil nu, amplifiant efficacement l'activité lytique des bactéries du phage et permettant leur énumération.

Le nombre de plaques sur un plat Petri sont appelés unités de formation de plaque, ou PFUs, et, à condition que la concentration initiale de bactériophage était suffisamment diluée, devrait correspondre directement au nombre de particules de phage infectieux dans l'échantillon original. Cette technique peut également être utilisée pour la caractérisation de la morphologie de la plaque, pour aider à l'identification des types de phages, ou pour isoler les mutants phages. Dans ce laboratoire, vous apprendrez à effectuer l'exemple de l'épispourration des phages, en utilisant le phage T7 de E. coli.

Tout d'abord, identifier un milieu approprié pour la culture des cellules bactériennes hôtes et le bactériophage. Ici, le bouillon de lysogénie, ou médium LB, a été utilisé pour la culture E. coli et le phage T7. Ensuite, prenez trois bouteilles en verre propre et les étiqueter avec des médias, le nom, puis le premier comme LB-Broth, le second comme LB-Bottom Agar, et le troisième comme LB-Top Agar. Maintenant, peser quatre grammes de poudre PRÉ-formulée LB en trois ensembles, puis transférer un ensemble de supports séchés pesés dans chaque bouteille. Ajouter 200 millilitres d'eau à la première bouteille. Mélanger le contenu à l'aide d'une barre magnétique.

Puis, à l'aide d'un pH mètre et en remuant constamment, porter le pH final à 7,4 grâce à l'ajout d'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique. Répétez l'ajout d'eau et l'ajustement du pH pour les deux autres bouteilles restantes, ainsi. Maintenant, peser trois grammes de poudre d'agar et l'ajouter à la deuxième bouteille pour faire une agar de 1,5 % de fond. Enfin, peser 1. 2 grammes d'agar et l'ajouter à la troisième bouteille pour faire l'agar haut de 0,6 % LB. L'état de bouillon dans la bouteille on n'a pas besoin d'un ajout d'agar. Capuchon de la bouteille semi-serré, puis, stériliser les médias en autoclant à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois terminés, retirer les bouteilles de l'autoclave et rordre immédiatement les bouchons de bouteille pour les fermer complètement afin d'éviter la contamination. Gardez les médias LB-Broth et LB-Top Agar sur le banc pour une utilisation ultérieure. Placez l'agar LB-Bottom pour refroidir dans un bain d'eau qui est préréglé à environ 45 degrés Celsius.

Lorsque l'agar LB-Bottom atteint environ 45 degrés Celsius, transférez-la sur le banc de travail. Ensuite, stériliser l'espace de travail à l'aide de 70 % d'éthénol. Ensuite, ajoutez 450 microlitres de chlorure de calcium stérile d'une molaire à la gélose du fond fondu pour faire une concentration finale de 2,25 millimolar. Faites tourbillonner doucement la bouteille pour mélanger. Ensuite, mettre en place sept plats Petri propres. Étiquetez chaque plat sur le fond avec le nom du média et la date de préparation. Ensuite, versez 15 millilitres de la gélose inférieure dans chacun des sept plats Petri. Laisser les assiettes reposer pendant quelques heures ou toute la nuit à température ambiante. Une fois fixées, les plaques de culture peuvent être stockées à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours si nécessaire, à l'envers pour minimiser la condensation. Transférer les plats Petri du réfrigérateur de 4 degrés Celsius dans un incubateur de 37 degrés Celsius une heure avant l'assidu.

La veille de l'assiduité, la bactérie E. coli doit être cultivée. Ici, 10 microlitres de la culture E. coli ont été inoculés en 10 millilitres de LB-Broth. Placez les bactéries à croître pendant la nuit dans un incubateur secouant réglé à 37 degrés Celsius à 160 tr/min. Puis, le jour de l'assidu, retirer la culture bactérienne de l'incubateur. Ensemencer un frais 10 millilitres de bouillon LB frais avec 0,5 millilitres de la culture du jour au lendemain. Placez ces cellules pour se développer dans un incubateur secouant réglé à 37 degrés Celsius à 160 rPM. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre pour vérifier quand cette culture atteint la croissance de la phase de journal, indiquée par une densité optique de 0,5 à 0,7. Une fois que l'OD atteint ce niveau, arrêter l'incubation en transférant la culture cellulaire sur le banc. Ils sont maintenant prêts à être utilisés pour l'assougage de la pariation de phage.

Les titers de phage peuvent varier exponentiellement selon les types de phages et les échantillons. Ainsi, afin de les compter efficacement, ils doivent être dilués pour générer un large éventail de concentrations de phages. Le jour de l'assidu, générer une série de dilutions phage allant d'un dixième à un millionième de concentrations, suivant une technique de dilution 10 fois. Pour obtenir des données statistiquement significatives et précises, effectuez la dilution en série en triple.

Ensuite, faire fondre l'agar SOLIDifié LB-dessus à l'aide d'un four à micro-ondes. Ensuite, placez-le dans un bain d'eau qui est préréglé à 45 degrés Celsius pendant une heure. Après une heure, recueillir les plats Petri contenant la couche inférieure d'agar de l'incubateur. Étiqueter les plaques avec une concentration de phage et une date d'assidu. Ensuite, mettre en place sept tubes à essai propres. Étiquetez chaque tube à essai avec le numéro de dilution de phage en série et désignez-en un comme contrôle.

Lorsque l'agar LB-dessus atteint 45 degrés Celsius, le transférer sur le banc de travail. Maintenant, ajoutez 450 microlitres d'un chlorure de calcium molaire à l'agar de 200 millilitres pour faire une concentration finale de 2,25 millimolar. Faites tourbillonner doucement la bouteille pour mélanger. Ensuite, ajoutez 35 millilitres d'agar LB-top et quatre millilitres de suspension bactérienne à un tube conique stérile. Tourbillonner doucement pour répartir uniformément les cellules, mais éviter de secouer pour éviter l'écume.

Maintenant, aliquot cinq millilitres de cette bactérie-top mélange d'agar à chacun des sept tubes à essai. Ensuite, transférez 100 microlitres des échantillons de bactériophage dilués en série et contrôlez les supports, qui devraient être simplement des médias sans bactériophage, vers les tubes à essai étiquetés respectueusement. Faire tourbillonner doucement le mélange pour assurer un bon mélange. Transférer délicatement cinq millilitres de mélange bactériophage sur la plaque Petri respective. Étendre uniformément le mélange sur toute la surface en faisant tourbillonner doucement la plaque Petri.

Une fois que toutes les plaques Petri sont superposées avec le mélange, permettre la solidification de la couche supérieure en couve à température ambiante pendant 15 minutes. Après l'achèvement de ces étapes, répéter le processus pour la deuxième, puis les troisièmes ensembles de la vaisselle Petri en utilisant les deux autres ensembles de dilutions phage. Sceller chaque plat avec du parafilm et couver à température ambiante pendant 15 minutes. Placez la plaque de culture à l'envers à une température appropriée pendant 24 heures ou jusqu'à ce que les plaques se développent. Ici, des plaques ont été placées dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant une journée, un état de croissance stimulant pour E. coli et le phage T7.

Les plaques apparaîtront après un à cinq jours d'incubation, selon les espèces bactériennes, les conditions d'incubation et le choix du milieu. Ici, les plaques étaient visibles après une journée d'incubation à 37 degrés Celsius. Commencez par vérifier les plaques marquées de contrôle et assurez-vous qu'aucune plaque n'a été formée dans ces plaques, car cela indiquerait une contamination virale. Pour déterminer le téter phage dans l'échantillon d'origine, commencez par les plaques contenant l'échantillon de phage le plus dilué en premier et comptez les plaques sans enlever les couvercles, en les marquant pour indiquer lesquelles ont déjà été comptées. Répétez le comptage pour chaque assiette dans chaque ensemble. Certaines plaques peuvent avoir trop ou trop peu de plaques à compter. Considérez 10 à 150 comme un nombre idéal de plaque.

Ensuite, générer un tableau énumérant les valeurs du nombre de plaque pour les différentes dilutions et répliques. Ensuite, calculez les valeurs moyennes du nombre de plaques pour les plaques de dilution qui contenaient le nombre idéal de numérations de plaques. Dans cet exemple, il s'agissait du nombre moyen de plaques formées dans les plaques 10 à moins trois et 10 aux plaques de dilution moins quatre. Maintenant, ajustez pour le facteur de dilution de phage en divisant les valeurs moyennes obtenues de plaque par les facteurs respectifs de dilution de phage. Ici, le nombre moyen de plaques formées à la 10 à la moins trois et 10 à la moins quatre plaques de dilution, ont été divisés par leurs facteurs de dilution respectifs pour obtenir le nombre d'unités de formation de plaque, ou PFUs, dans 100 microlitres de mélange de phage. Pour convertir la valeur en PFU par millilitre, multipliez les valeurs générées par 10, car seulement 100 microlitres de mélange de dilution de phage ont été utilisés pendant l'étape de préparation de la superpose bactériophage, produisant un facteur de dilution supplémentaire de 10. Enfin, calculez la moyenne des valeurs obtenues à partir des différentes plaques de dilution. Cela donnera le nombre moyen de PFUs par millilitre. Le nombre de PFU correspond au nombre de particules de phage infectieux dans l'échantillon d'origine.

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