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Conjugación: Un método para transferir la resistencia a la ampicilina del donante al destinatario E. coli

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Las células bacterianas, como E. coli,son capaces de transferir información genética de célula a célula. La conjugación difiere de otros mecanismos de transferencia de ADN, como la transducción o la transformación, en el que requiere contacto físico entre las células.

Para proceder, la conjugación requiere una célula donante que exprese la fertilidad, o factor F, y una célula receptora sin ella, una célula Menos F. El proceso requiere dos pasos. El primero es el establecimiento de contacto directo de célula a célula. Para ello, la célula donante genera una estructura filamentosa extracelular llamada sex pilus. Se llama esto ya que la conjugación es una forma de apareamiento para la reproducción asexual de bacterias, pero cabe señalar que no es verdadera reproducción sexual ya que no se intercambian gametos y no se forman descendencia.

El segundo paso es la entrega de ADN a la célula receptora. Después de que el sex pilus establece el contacto entre dos células, se construye un conducto llamado sistema de secreción tipo IV que permite la transferencia de ADN. La célula donante comienza entonces a replicar el ADN extracromosómico que se transferirá seleccionado en función de la presencia de un elemento genético conocido como OriT u origen de la transferencia. Un extremo del ADN recién replicado se introduce en el conducto a través de la unión a proteínas de ADN. A medida que el ADN se replica aún más, se bombea a través del canal, facilitado por un complejo de proteínas codificadas por genes situados cerca del OriT. Una vez que el ADN se transfiere completamente, formará un plásmido cromosómico adicional, o puede integrarse en el cromosoma de la célula receptora. Cualquiera que sea el punto final del ADN transferido, los genes que codifica serán expresados. Esta expresión génica se puede utilizar para confirmar la conjugación exitosa.

Por ejemplo, considere un escenario en el que la cepa del donante expresa resistencia a la ampicilina y lo transmite en el ADN conjugado a la bacteria receptora, pero la cepa receptora también tiene un gen de resistencia a la tetraciclina que no está presente en el donante. En este caso, cuando las células están chapadas en medios LB que contienen tetraciclina y ampicilina, las colonias deben crecer sólo a partir de bacterias conjugadas con éxito, que expresarán ambos fenotipos de resistencia. Para confirmar aún más la conjugación exitosa, se puede cosechar ADN plásmido de estas colonias y luego se puede amplificar una sección de ADN específica del plásmido transferido utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR. Cuando el producto PCR se ejecuta con un gel de electroforesis junto con una escalera de tamaños estándar, un fragmento de PCR de un tamaño conocido debe ser visible en el gel, lo que confirma aún más la conjugación exitosa. En este experimento, se utilizará un plásmido para transferir el gen de resistencia a la ampicilina a través de la conjugación de una cepa de donante a una cepa receptora resistente a la tetraciclina. Después de esto, para confirmar la conjugación, la mezcla de conjugación se incubará en una placa que contiene ambos antibióticos dejando sólo las bacterias transformadas. Por último, la conjugación exitosa se confirmará aún más con la PCR.

Antes de iniciar el procedimiento, ponte el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes. A continuación, esterilizar el espacio de trabajo con 70% de etanol para limpiar la superficie.

En este procedimiento, el gen de resistencia a la ampicilina se transferirá de la cepa WM3064 de E. coli a la cepa J53 de E. coli mediante conjugación. La cepa de donante WM3064 es resistente a la tetraciclina y a la ampicilina y requiere ácido diaminopimelico, o DAP, para crecer. La cepa receptora J53 sólo es resistente a la tetraciclina y no requiere DAP para crecer. Esto significa que las células conjugadas con éxito deben ser resistentes a la tetraciclina y la ampicilina y pueden crecer sin DAP.

Preparar el cultivo de cepa de donante inoculando cinco mililitros de LB que contienen 0,3 milimoles de DAP con un trozo de la población de glicerol de cepa de donante congelado. A continuación, prepare la cepa receptora inoculando cinco mililitros de caldo LB sin DAP con un trozo de la cepa congelada de glicerol. Cultivar estos cultivos durante la noche a 37 grados centígrados con aireación y temblor a 220 RPM en una incubadora temblorosa. Una vez que los cultivos han crecido a una Do 600 de dos, retire un mililitro de cultivo de cada uno y colóquelo en dos nuevos tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros. Luego, centrifugar estas alícuotas a 3000 RPM durante cinco minutos para peletizar las células bacterianas. Deseche el sobrenadante y lave cada pellet con 250 microlitros de 1X PBS. Centrifugar las muestras de nuevo y, después de desechar el sobrenadante, resuspender cada pellet en 500 microlitros de PBS.

Para comenzar el procedimiento de conjugación, primero combine 50 microlitros de células receptoras con 50 microlitros de células donantes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente. A continuación, pipeta 100 microlitros del cultivo de células receptoras en otra placa de tetraciclina 1X que contenga DAP. A continuación, prepare su control negativo pipeteando 100 microlitros del cultivo de células receptoras solo en una placa de agar no selectiva que contenga DAP. Luego, incubar las placas de conjugación y control negativo durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, tomar un rascador de células estériles y cosechar células de la placa de conjugación mediante la recolección de colonias. A continuación, transfiera las colonias a un tubo estéril de 1,5 mililitros de microcentrífuga que contenga un mililitro de 1X PBS. Repita este proceso para recoger las celdas receptoras de la otra placa.

Después de esto, vórtice las muestras para mezclar. Después de mezclar, transfiera los tubos a una centrífuga para peletizar suavemente las células. Deseche el sobrenadante, luego lave los gránulos celulares en un mililitro de PBS y vórtice los tubos para resuspender las células. Revuelva las células centrifugando. Deseche el sobrenadante de nuevo y vuelva a suspender ambos pellets celulares en un mililitro de PBS. Ahora, usando una punta de pipeta estéril, placa 100 microlitros de la mezcla de células de reacción de conjugación en una placa de agar LB sin DAP que contiene 1X tetraciclina y 1X ampicilina. Repita el método de chapado utilizando 100 microlitros de una dilución de diez veces de la misma mezcla celular en PBS en otra placa de agar LB sin DAP que contenga 1X tetraciclina y 1X ampicilina.

Por último, pipeta 100 microlitros de la mezcla de células de control negativas en una sola placa de agar LB con 1X tetraciclina solamente. Después de la incubación durante la noche a 37 grados centígrados, las colonias deben ser visibles. Usando una punta de pipeta estéril, escoja una sola colonia de la placa de reacción de conjugación y agréguela a un tubo que contenga cinco mililitros de medios selectivos de LB que contengan ambos antibióticos. Luego, repita el aislamiento de la colonia seleccionando una sola colonia de la placa celular receptora. Cultivar estos cultivos durante la noche a 37 grados centígrados con aireación a 220 RPM.

Al día siguiente, limpie la parte superior del banco con 70% de etanol y retire las placas de la incubadora. Utilice un mini kit de preparación de ADN para aislar el ADN de 4. 5 mililitros de cada cultivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de completar la mini preparación del ADN, eluda el ADN usando 35 microlitros de agua libre de nucleasas. Por último, utilice el 0 restante. 5 mililitros de cada cultivo para preparar existencias de glicerol de un mililitro añadiendo 0,5 mililitros de 100% de glicerol para una dilución uno a uno. Coloque estas alícuotas a menos 80 grados Centígrados para su almacenamiento hasta que sea necesario.

Para confirmar la conjugación exitosa por PCR, primero prepare una mezcla maestra de PCR añadiendo 75 microlitros de mezcla maestra de PCR 2X a un tubo de microcentrífuga. A continuación, agregue 7,5 microlitros cada uno de una imprimación delantera de 10 micromolares y una imprimación inversa de 10 micromolares diseñada para amplificar el gen de resistencia a la ampicilina del plásmido. A continuación, prepare una segunda mezcla maestra de PCR añadiendo 75 microlitros de mezcla maestra de PCR 2X a un tubo de microcentrífuga y luego agregando 7,5 microlitros cada uno de una imprimación delantera de 10 micromolares y una imprimación inversa micromolar de 10 molares diseñada para amplificar un gen de limpieza, en este caso ADN gyrase B.

Ahora, agregue 15 microlitros de la primera mezcla maestra a un tubo PCR y luego agregue 10 nanogramos, aproximadamente dos microlitros de la plantilla de ADN experimental al mismo tubo. Lleve la reacción a un volumen final de 25 microlitros con agua libre de nucleasas. Repita estos pasos para producir las cinco reacciones restantes, de modo que los tubos contengan los componentes que se muestran aquí. Ahora, transfiera estas reacciones a un termociclador con el bloque precalentado a 98 grados Celsius y luego inicie el programa. Después de completar el PCR, retire los tubos de la máquina. A continuación, cargue dos microlitros de cada reacción mezclados con dos microlitros de colorante de carga y cuatro microlitros de un marcador de peso molecular en pozos consecutivos de un gel de agarosa del 1%. Ajuste el gel para que funcione a 150 voltios durante 20 minutos. Por último, visualice el gel con un iluminador UV.

En este experimento, se confirmó la transferencia exitosa del gen de resistencia a la ampicilina a través de la conjugación a través de la PCR. Aquí, se debe observar una banda de aproximadamente 500 pares base de tamaño en el pozo que contiene el ADN conjugado y los imprimadores de ampicilina, así que dos en este ejemplo. Un gen de limpieza, la gen de la gen de la gen de la gen del ADN B, se cargó en los pozos tres y cinco con ADN conjugado y ADN de células receptoras, respectivamente. Las bandas observadas en estos pozos actúan como un control positivo para asegurar que la plantilla de ADN estuviera presente y que la PCR tuviera éxito. No se deben observar bandas en el pozo que contiene la reacción para el ADN de las células receptoras y el par de imprimación de ampicilina, bien cuatro en este ejemplo, porque las células receptoras no son resistentes a la ampicilina. Además, no se deben observar bandas en las reacciones que carecen de ADN de plantilla, pozos seis y siete aquí. Si se cumplen estas condiciones, esto confirmará la transferencia exitosa del gen de resistencia a la ampicilina, confiriendo resistencia a la ampicilina de la cepa WM3064 de E. coli a la cepa J53 de E. coli.

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