Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

טרנסדוקציה של פאג'
 
Click here for the English version

טרנסדוקציה של פאג': שיטה להעברת עמידות לאמפיצ'ילין מתורם לנמען E. coli

Overview

מקור: אלכסנדר ס. גולד1, טוניה מ. קולפיטס1
1 המחלקה למיקרוביולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת בוסטון, המעבדות הלאומיות למחלות זיהומים מתעוררות, בוסטון, תואר שני

טרנסדוקציה היא צורה של החלפה גנטית בין חיידקים המשתמשים בבקטריופאג'ים, או פאג'ים, סוג של וירוס שמדביק אורגניזמים פרוקריוטים בלבד. צורה זו של העברת דנ"א, מחיידק אחד למשנהו באמצעות פאג', התגלתה בשנת 1951 על ידי נורטון זינדר ויהושע לדארג, שכינו את התהליך "טרנסדוקציה" (1). בקטריופאג'ים התגלו לראשונה בשנת 1915 על ידי הבקטריולוג הבריטי פרדריק טוורט, ואז התגלו שוב באופן עצמאי בשנת 1917 על ידי המיקרוביולוג הצרפתי-קנדי פליקס ד'הרל (2). מאז, המבנה והתפקוד של פאג'ים אלה התאפיינו באופן נרחב (3), וחלוקת פאג'ים אלה לשתי כיתות. הראשון מבין שיעורים אלה הם פאג'ים ליטיים אשר עם זיהום להתרבות בתוך החיידק המארח, לשבש את חילוף החומרים החיידקי, lysing התא, ושחרור פאג צאצאים (4). כתוצאה מפעילות אנטי-בקטריאלית זו והשכיחות הגוברת של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה, פאגים ליטיקיים אלה הוכיחו לאחרונה שימושי כטיפול חלופי לאנטיביוטיקה. השני של שיעורים אלה הם פאג'ים ליזוזניים שיכולים להתרבות בתוך הפונדקאי דרך מחזור הטיק או להיכנס למצב של קיפיון שבו הגנום שלהם משולב בזה של הפונדקאי (איור 1), תהליך המכונה ליסוגניה, עם היכולת לייצר פאג' להיות מושרה בעוד דורות רבים מאוחרים יותר (4).

Figure 1
איור 1: זיהום של תא מארח על ידי בקטריופאג'. ספיחה על ידי הפאג ' לקיר התא החיידקי באמצעות אינטראקציות בין סיבי הזנב לקולטן (סגול). ברגע על פני התא, הפאג' מחובר באופן בלתי הפיך לתא החיידקי באמצעות לוח הבסיס (שחור) המועבר לקיר התא על ידי נדן הציר (צהוב). גנום פאג' (אדום) נכנס לתא ומשתלב בגנום התא המארח.

בעוד טרנסדוקציה חיידקית היא תהליך טבעי, באמצעות טכנולוגיה מודרנית זה כבר מניפולציה להעברת גנים לחיידקים בסביבת המעבדה. על ידי החדרת גנים מעניינים לגנום של פאג' ליזוזני, כגון פאג ', ניתן להעביר גנים אלה לגנומים של חיידקים וכתוצאה מכך לבטא אותם בתוך תאים אלה. בעוד ששיטות אחרות להעברת גנים, כגון טרנספורמציה, משתמשות בפלסטיד להעברת גנים וביטוי, החדרת הגנום הפאג' לזה של חיידק הנמען לא רק שיש לה פוטנציאל להעניק תכונות חדשות לחיידק זה, אלא גם מאפשרת מוטציות טבעיות וגורמים אחרים של הסביבה התאית לשנות את תפקוד הגן המועבר.

בהשוואה לשיטות אחרות של העברת גנים אופקית, כגון הטיות, התמלה גמישה למדי בקריטריונים הנדרשים לתאי תורמים ונמענים. כל אלמנט גנטי שיכול להתאים בתוך הגנום של הפאג ' בשימוש יכול להיות מועבר מכל זן של חיידקים תורמים לכל זן של חיידקים נמענים כל עוד שניהם מתירניים הפאג ', הדורש ביטוי של קולטני פאג 'הדרושים על משטחי התא. ברגע שהגן הזה מועבר מהגנום התורם ונארז לתוך הפאג', ניתן להעביר אותו לנמען. לאחר התמסורת, יש צורך לבחור עבור חיידקים נמענים המכילים את הגן של עניין יש לבחור עבור. זה יכול להיעשות על ידי שימוש בסמן גנטי, כגון FLAG-tag או תג פוליהיסטידין, כדי לסמן את הגן של עניין, או את הפונקציה המהותית של הגן, במקרה של גנים המקודדים עמידות לאנטיביוטיקה. בנוסף, ניתן להשתמש ב- PCR כדי לאשר עוד יותר את התמרה מוצלחת. על ידי שימוש בפריימרים לאזור בתוך גן העניין והשוואת האות לשליטה חיובית, חיידקים בעלי גן עניין ושליטה שלילית, חיידקים עברו את אותם צעדים כמו תגובת התמרה ללא פאג '. בעוד טרנסדוקציה חיידקית היא כלי שימושי בביולוגיה מולקולרית, יש לה וממשיכה למלא תפקיד חשוב בהתפתחות החיידקים, במיוחד לגבי העלייה האחרונה של עמידות לאנטיביוטיקה.

בניסוי זה, טרנסדוקציה חיידקית שימשה להעברת קידוד הגן לעמידות באמפיצלין אנטיביוטי מזן W3110 של E.coli לזן J53 באמצעות בקטריופאג ' P1 (5). ניסוי זה כלל שני שלבים עיקריים. ראשית, הכנת P1 פאג ' המכיל את הגן עמידות אמפיצלין מן זן התורם. שנית, העברת הגן הזה לזן הנמען על ידי טרנסדוקציה עם P1 phage (איור 1). לאחר ביצועו, ההעברה המוצלחת של הגן עמידות אמפיצלין יכולה להיקבע על ידי qPCR (איור 2). אם התמרה הייתה מצליחה, זן J53 של E. coli יהיה עמיד בפני אמפיצ'ילין, והגן המעניק התנגדות זו ניתן לזיהוי על ידי qPCR. אם לא יצליח, לא יהיה זיהוי של הגן עמידות אמפצילין ואמפצילין עדיין יתפקד כאנטיביוטיקה יעילה נגד זן J53.

Figure 2
איור 2: אישור התמרה מוצלחת על ידי qPCR. על ידי השוואת ערכי Cq שזוהו עבור גן העניין מתגובת התמרה ותגובת השליטה השלילית, ונורמול ערכים אלה מול גן משק בית, ניתן היה לאשר כי טרנסדוקציה חיידקית הצליחה.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הגדרת

  1. לפני תחילת כל עבודה המערבת חיידקים, לעקר את סביבת העבודה באמצעות 70% אתנול. השתמש תמיד PPE הדרוש (חלוק מעבדה וכפפות).
  2. ודא כי לוחות אגר LB עם אמפיצילין 1x, פתרון P1 phage ליסאט זמין מסחרית, כלורופורם, 1 M נתרן סיטראט, גליצלול, וקופסה של טיפים פיפטה פלסטיק מעוקר מראש ומפזרי תאים נמצאים בהישג יד.
  3. הכן LB סטרילי על ידי autoclaving ולהשתמש בו כדי להפוך שלושה 1 mL aliquots של פתרון מלח LB.
    1. mM MgCl2 (952.11-2.3803 מיקרוגרם), 5 מ"מ CaCl2 (11.098 מ"ג), 0.1-0.2% גלוקוז (100-200 מיקרוגרם)
    2. מ"מ MgSO4 (12.0366 מ"ג), 5 מ"מ CaCl2 (11.098 מ"ג)
    3. mM נתרן סיטראט (25.806 מ"ג)
  4. לאחר סיום, לחטא את כל המשטחים, כמו גם כפפות עם 70% אתנול לשטוף ידיים.

2. פרוטוקול

  1. תורם פאג' ליסאט הכנה
    1. הכן תרבות 1 מ"ל של תורם W3110 זן E. coli ב LB עם אמפיצלין 1x גדל לילה ב 37 °C (77 °F) עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
    2. לדלל את זה תרבות לילה 1:100 ב 1 מ"ל של LB טרי בתוספת 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, ו 0.1-0.2% גלוקוז.
    3. לגדל את זה דילול חיידקי ב 37 °C (50 °F) במשך 2 שעות עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
    4. לאחר תאים אלה הגיעו לשלב הצמיחה הלוגריתמית המוקדמת (צמיחה ניכרת וערבולות קלות), להוסיף 40 μL של P1 phage זמין מסחרית ולהשאיר ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
      1. לפני תוספת פאג', הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 ננומטר של תאים אלה צריכה להיות בערך 0.4 (6).
    5. נטר את התאים במשך 1-3 שעות עד שתרבית התסיסה.
      1. תמיס תגרום לפסולת תאית מוגברת, כמו גם לירידה ניכרת בעכורה (כלומר תאים ייחשבו lysed ברגע אחד הוא מסוגל לראות דרך התרבות).
    6. הוסף מספר טיפות (50-100 μL) של כלורופורם ליסאט ומערבבים על ידי מערבולת.
      1. כלורופורם מעקר את הפאג' ליסאט על ידי הריגת כל התאים התורמים הנותרים, משאיר רק פאג' ומגדיל את הצמיג של ליסאט זה.
    7. צנטריפוגה lysate ב 14,000 סל"ד במשך 2 דקות כדי להסיר פסולת ולהעביר supernatant לצינור טרי.
    8. מוסיפים כמה טיפות של כלורופורם ומאחסנים ב 4 °C (70 °F) לא יותר מיום אחד.
  2. טרנסדוקציה
    1. הכן תרבות 1 מ"ל של נמען זן J53 E. coli גדל לילה ב LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
    2. העבר 100 μL של תורם פאג ליסאט (2.1) לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל ודגרה עם כובע פתוח ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות.
      1. דגירה זו מאפשרת לכל כלורופורם שנותר בתמיסת ה- P1 lysate להתאדות לפני הוספתו לתאי הנמען.
    3. מסנן כדורים בעדינות מתאי צנטריפוגה ב-6,000 סל"ד למשך 5 דקות.
    4. Resuspend תאים אלה ב 300 μL של LB טרי המכיל 100 mM MgSO4 ו 5 mM CaCl2. (P1 phage דורש סידן להיות זיהומיות).
    5. הגדר שתי תגובות באמצעות תאי חיידקי הנמען והכנת פאג ' ליסאט תורם: 1) תגובת טרנסדוקציה המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL תורם פאג 'ליסאט, ו 2) שליטה שלילית המשלבת 100 נמען μL J53 זן E. coli ו 100 μL של LB המכיל 100 mM MgSO4 ו 5 mM CaCl2.
    6. דגירה ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות עם רועד ב 220 סל"ד.
    7. הוסף 1 מ"ל LB ו 200 μL 1M נתרן סיטראט (pH = 5.5) ודגרה במשך שעה אחת ב 37 °C (57 °F) עם רועד ב 220 סל"ד.
      1. סיטראט משמש כדי להפחית את ההדבקה של P1 על ידי כלאט עם סידן, מניעת תמוגה של חיידקים המטופל.
      2. דגירה של פתרון זה מאפשרת את הביטוי של סמן התנגדות אמפיצלין.
    8. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 סל"ד במשך 5 דקות.
    9. כדורי תא resuspend ב 100 μL של LB עם 100 mM נתרן ציטוט (pH 5.5). מערבולת וצלחת פתרון שלם עבור שתי התגובות על שתי צלחות אגר LB.
      1. צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
      2. P1 זיהום פאג ' על צלחת זו דורש פסים מחדש לפני מלאי המקפיא ניתן להכין.
      3. אם פאג' לא יוסר, תרבויות הגדלות ממושבות אלה לא יגדלו אלא אם כן בנוכחות כלטור סידן.
    10. בחר כ 3-4 מושבות משתי הצלחות ופס שוב על שתי צלחות אגר LB להתפשט עם 100 μL של 1 M נתרן סיטראט (pH = 5.5).
      1. צלחת LB צריך להיות 1x Amp עבור מדגם transduced ולא מגבר עבור השליטה השלילית.
    11. לדגור על הצלחות ב 37 °C (55 °F) לילה כדי לאפשר מושבות ללא פאג לגדול.
    12. בחר מושבות משתי הצלחות והשתמש בהן כדי לגדל תרביות לילה ב 5 מ"ל של LB ב 37 °C עם aeration ורעד ב 220 סל"ד.
    13. לבודד DNA מתרביות אלה על ידי DNA miniprep באמצעות 4.5 מ"ל של נפח התרבות הכולל.
      1. יש לפנות דנ"א באמצעות 35 מיקרו-אל של מים נטולי נוקלאז.
      2. למדוד את הריכוז המתקבל על ידי Nanodrop. DNA טהור ייצור יחס ספיגה (A260/280) של כ 1.8.
    14. השתמש 0.5 מ"ל הנותרים של כל תרבית כדי להכין 1 מ"ל מניות גליצרול על ידי ביצוע תערובת 1:1 של 100% גליצרול ותרבות חיידקים.
    15. לאחסן מלאי גליסול חיידקי ב -80 °C (50 °F).

3. ניתוח נתונים ותוצאות

  1. אישור התמרת על-ידי qPCR
    1. הכן שני תערובות מאסטר qPCR עבור שש תגובות qPCR, שלושה באמצעות פריימרים qPCR עבור הגן התנגדות אמפיצלין, ושלושת האחרים באמצעות פריימרים qPCR עבור גן משק בית (14.5 μL לתגובה): 12.5 μL qPCR חיץ לערבב + 1 μL פריימר קדימה + 1 μL פריימר הפוך.
      1. בניסוי זה, השתמשנו בתערובת מאסטר ירוק SYBR.
      2. פריימרים של גנים של משק בית תוכננו להגביר מקטע דנ"א בתוך קידוד הגן החיידקי עבור gyrase DNA B (7).
    2. עבור כל תגובת qPCR, שלב 100 מיקרוגרם של DNA מכל תגובה (10.5 μL) עם 14.5 μL של תערובת מאסטר qPCR.
    3. באמצעות מכונת qPCR ופרוטוקול התרמו-אופניים המפורט בטבלה 1, נמדדה הגברה עבור עמידות האמפיצלין וגנים משק בית עבור כל שש התגובות.
    4. ערכי Cq שנוצרו על ידי qPCR שימשו לחישוב יעילות התמסורת מנורמלת של הגן עמידות אמפיצלין (איור 3), המאשר את התמרה המוצלחת של הגן עמידות אמפיצלין.
      1. ערך Cq, או ערך כימות המחזור, של מדגם הוא מספר מחזור ה- PCR המוקדם ביותר שבו מזוהה אות חריגה מסף הרקע. ערכי Cq נמוכים תואמים לרצף יעדים נוסף, להיפך.
      2. יעילות טרנסדוקציה מנורמלת של גן בתוך מדגם ניתן לחשב באמצעות ערכי Cq אלה על ידי חיסור הערך של הגן משק הבית מזה של גן היעד, יצירת ערך ΔCq, אשר ניתן להשתמש בו כדי לחשב יעילות transduction מנורמל על ידי 2(-ΔCq).
טמפרטורה זמן
דנטורציה 94 °C (77 °F) 2 דקות
40 מחזורים:
דנטורציה 94 °C (77 °F) 15 שניות
קריאה על חישול, הארכה ופלואורסצנטיות 60 °C (5 °F) או 5 °C (5 °F) מתחת לראש הממשלה הנמוך ביותר Tm 1 דק'

טבלה 1: פרוטוקול תרמורכיבה על אופניים qPCR

חיידקים יכולים להסתגל במהירות לסביבה המשתנה במהירות על ידי החלפת חומר גנטי ודרך אחת שהם יכולים לעשות זאת היא באמצעות טרנסדוקציה, חילופי חומר גנטי בתיווך וירוסים חיידקיים. בקטריופאג', שלעתים קרובות מקוצר לפייג', הוא סוג של וירוס שמדביק חיידקים על ידי הצמדה תחילה לפני השטח של הפונדקאי ולאחר מכן הזרקת ה- DNA שלו לתא החיידקי. לאחר מכן הוא משפיל את הדנ"א של התא המארח ומשכפל את הגנום הנגיפי שלו, תוך חטיפת מכונות התא כדי לסנתז עותקים רבים של החלבונים שלו. חלבוני פאג' אלה מרכיבים את עצמם אורזים את הגנום של הפאג' ויוצרים צאצאים מרובים. עם זאת, בשל הנאמנות הנמוכה של מנגנון אריזת ה- DNA, מדי פעם, הפאג 'אורז שברים של DNA חיידקי לתוך capsid phage. לאחר גרימת תמוגה של המארח, הצאצאים פאג 'משתחררים, ברגע פאג כזה מדביק תא מארח אחר, הוא מעביר את שבר ה- DNA של המארח הקודם שלה. לאחר מכן זה יכול לשלב מחדש ולהיות משולב לצמיתות בכרומוזום של הפונדקאי החדש, ובכך לתווך העברת גנים בין שני החיידקים.

כדי לבצע טרנסדוקציה של פאג' במעבדה נדרש זן תורם המכיל גן של עניין, זן נמען חסר אותו, פאג 'שיכול להדביק הן את הזנים, ושיטה לבחור את החיידק transduced. ברוב המקרים, זו תהיה מדיה צמיחה מוצקה סלקטיבית התומכת בצמיחה של חיידקים transduced אבל מעכב את הצמיחה של אלה שאינם transduced. בתור התחלה, זן התורם המכיל את גן העניין הוא מתורבת במדיום צמיחה נוזלי. כאשר כל החיידקים מתחלקים באופן פעיל בשלב היומן של צמיחתם, התרבות מחוסנת עם פאג' היעד. לאחר שלוש עד ארבע שעות של דגירה, כאשר כמעט כל החיידקים lysed ושחררו את חלקיקי הפאג ', התורם phage lysate מחוסן לתוך תרבות גדל טרי של זן חיידקי הנמען. לאחר דגירה קצרה של שעה אחת, התרבות צריכה כעת להכיל תערובת של תאים חיידקיים transduced ולא transduced וזה מוקרן עבור התאים transduced על ידי הפצת שבריר של ההשעיה על מדיה צמיחה סלקטיבית סלקטיבית מתאימה. עם דגירה נוספת, התאים המועברים צריכים לגדול ולהתרבות כדי להניב מושבות נראות לעין. לאחר מכן ניתן לבחור מושבות אלה לניתוח נוסף באמצעות מגוון שיטות כדי לאשר עוד יותר טרנסולקציה מוצלחת, כגון PCR מושבה, ריצוף DNA, או PCR כמותי.

לפני תחילת ההליך, לבשו כל ציוד מגן אישי מתאים, כולל חלוק מעבדה וכפפות. לאחר מכן, לעקר את סביבת העבודה עם 70% אתנול ולנגב את פני השטח.

לאחר מכן, להכין שלושה aliquots מיליליטר של תמיסת מלח LB. עכשיו, להכין תרבית זן תורם על ידי הוספת 100 microliters של E. coli לטיל חרוט 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיום צמיחה LB עם 500 מיקרוגרם של אמפיצ'ין. לאחר מכן, לגדל את התרבות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם aeration ורעד ב 220 סל"ד. למחרת, לנגב את הספסל העליון עם 70% אתנול לפני הסרת התרבות מן האינקובטור רועד. לאחר מכן, לדלל את תרבות הלילה אחד עד 100 על ידי הוספת 10 microliters של זן התורם 990 microliters של LB טרי בתוספת תמיסה מלח.

אפשר דילול חיידקי לגדול ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עם aeration ורעד ב 220 סל"ד. לאחר שהתאים הגיעו לשלב היומן המוקדם, הסירו את התרבות מהאינקובטור, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של P1 phage לתרבות ודגרו שוב. המשך לעקוב אחר התאים במשך שעה עד שלוש שעות עד שתרבית התיר. לאחר מכן, להוסיף 50 עד 100 microliters של כלורופורם כדי ליסאט ולערבב על ידי מערבולת. לאחר מכן, צנטריפוגה ליסאט כדי להסיר פסולת ולהעביר את supernatant לצינור טרי. מוסיפים כמה טיפות של כלורופורם לסופר-טבעי ומאחסנים אותו בארבע מעלות צלזיוס לא יותר מיום אחד.

כדי להתחיל את הליך התמרה, להשיג תרבות מיליליטר אחד של זן המטופל. לאחר מכן, להעביר 100 microliters של פיג 'תורם ליזייט לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס עם המכסה פתוח במשך 30 דקות כדי לאפשר כלורופורם שנותר להתאדות. בעוד התורם lysate דגירה, גלולה את תאי המתח הנמען באמצעות צנטריפוגה עדינה. השליכו את הסופרנט והדביקו מחדש את גלולה התא ב-300 מיקרוליטרים של לירה טרייה המכילה 100 מילימולר מגנזיום גופרתי וחמישה מילימילימטרים של סידן כלוריד.

לאחר מכן, להגדיר את תגובת התמרה על ידי שילוב 100 microliters של זן הנמען ו 100 microliters של התורם פאג ליסאט בצינור microcentrifuge. לאחר מכן, להגדיר את השליטה השלילית על ידי שילוב 100 microliters של זן הנמען ו 100 microliters של LB עם מגנזיום גופרתי וסידן כלוריד. לאחר הדגירה, להוסיף 200 microliters של ציטוט נתרן טוחנת אחת מיליליטר אחד של LB לשני הצינורות, ומערבבים על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה. לאחר מכן, לאחר הצינורות כבר דגירה במשך שעה, בעדינות גלולה התאים באמצעות צנטריפוגה.

לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ול resuspend התאים כדורי ב 100 microliters של LB עם 100 מילימולר נתרן ציטוט. מערבולת את הפתרונות ואת pipette כל מדגם transduced על צלחת אגר LB עם אמפיצלין 1X. לבסוף, pipette את כל הנפח של תערובת תא שליטה שלילית על צלחת אגר LB ללא אמפצילין. לאחר הדגירה של הצלחות למשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, השתמש קצה פיפטה סטרילי לקטוף שלוש עד ארבע מושבות מלוח התמרה פסים אותם על צלחת אגר LB חדשה המכילה 1X אמפיצילין ו 100 microliters של ציטראט נתרן טוחנת אחת. חזור על שיטת ציפוי זו לשליטה השלילית על צלחת אגר LB אחרת המכילה רק 100 מיקרוליטרים של נתרן טוחן אחד ציטוטרט. לאחר מכן, לדגור על הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס לילה כדי לאפשר מושבות ללא פאג לגדול.

למחרת, לנגב את הספסל העליון עם 70% אתנול לפני הסרת הצלחות שלך מן האינקובטור. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, בחרו שלוש מושבות מצלחת התמרה והוסיפו אותן כל אחת לצינור נפרד המכיל חמישה מיליליטר של מדיית LB. לאחר מכן, בחר שלוש מושבות מצלחת הבקרה השלילית והוסף אותן לצינור אחר המכיל חמישה מיליליטר של מדיה LB. לגדל את התרבויות לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם aeration ורעד ב 220 סל"ד. לאחר עיקור החלק העליון של הספסל כפי שהודגם בעבר, השתמש בערכת מיני-הכנה של DNA כדי לבודד דנ"א מ-4.5 מיליליטר של כל תרבות בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, לחמוק ה- DNA עם 35 microliters של מים ללא נוקלאז ולמדוד את הריכוז המתקבל על ידי ספקטרופוטומטר מעבדה. לבסוף, להכין מניות גליצרל על ידי הוספת 0.5 מיליליטר הנותרים של שני פתרונות חיידקים 0.5 מיליליטר של 100% גלילסול.

כדי לאשר חילוף, הכינו תחילה שני תערובות מאסטר של qPCR לתגובות qPCR של 24 qPCR. לתערובת המאסטר הראשונה, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של תערובת חיץ qPCR לצינור מיקרוצנטריפוגה ו-12 מיקרוליטרים כל אחד מפריימר קדמי והפוך שנועד להגביר את הגן עמידות בפני אמפיצלין. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר qPCR שנייה על ידי הוספת 150 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר qPCR לצינור microcentrifuge ולאחר מכן הוספת 12 מיקרוליטרים כל פריימר קדמי פריימר הפוך שנועד להגביר גן משק בית.

עבור כל תגובת qPCR, שלבו 100 מיקרוגרם של דנ"א ניסיוני מכל תגובה עם 14.5 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר qPCR. עכשיו, להכין את התגובות הנותרות כפי שהוכח בעבר. להעביר את התגובות תרמוcycler מחומם מראש ל 94 מעלות צלזיוס ולאחר מכן ליזום את התוכנית. לבסוף, השתמש בערכי כימות המחזור, או Cq, שנוצרו על ידי qPCR כדי לחשב את יעילות התמרה מנורמלת של הגן התנגדות אמפיצלין.

כמות המחזור, או Cq, ערכים עבור הגנים של עניין היו tabulated עבור כל אחד מהפקדים השליליים ודגימות transduced. ערכי Cq נמוכים, בדרך כלל מתחת ל- 29 מחזורים, כגון הדגימות המועברות בדוגמה זו מציינים כמויות גבוהות של רצף היעד.

גן משק בית, גם הוא טבלאי כאן, משמש כבקרת טעינה כדי לנרמל את כמות ה- DNA בכל תגובה וכפקד חיובי כדי להבטיח את qPCR עובד. בתנאי שאותם כמויות של גן משק הבית נטענות, הוא נמצא בשיעור זהה יחסית בכל דגימה.

לאחר מכן, כדי לחשב את ערך דלתא Cq עבור כל מדגם, הפחת את ערך Cq של הגן משק הבית עבור כל דגימה מערך Cq של גן היעד המתאים שלה. לדוגמה, דלתא Cq של הפקד השלילי הראשון הוא 13.54. לאחר מכן, השתמש בערך זה כדי לחשב את יעילות התמרה מנורמלת של כל מדגם באמצעות הנוסחה המוצגת כאן. לבסוף, ניתן לחשב את יעילות התמסורת המנורמלת הממוצעת עבור כל קבוצת מדגם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העברת הגנים לחיידקים וממנה על ידי בקטריופאג', בעוד תהליך טבעי, הוכיחה את עצמה כיעילה ביותר להמון מטרות מחקריות. בעוד ששיטות אחרות להעברת גנים כגון טרנספורמציה והטיה אפשריות, התמרה משתמשת באופן ייחודי בבקטריופאג'ים; לא רק המאפשר שילוב גנים בגנום המארח, אלא גם להעברת גנים לחיידקים מרובים שאינם רגישים לשיטות אחרות. תהליך זה, בעוד שימושי במיוחד במעבדה, שימש גם בתחום המתפתח לאחרונה של ריפוי גנטי, ליתר דיוק בטיפול גנטי אלטרנטיבי, אסטרטגיה טיפולית המשתמשת בחיידקים כדי לספק טיפולים לרקמות היעד, שרבות מהן אינן רגישות לשיטות משלוח אחרות ויש להן רלוונטיות קלינית רבה (8,9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Lederberg J, Lederberg E.M., Zinder, N.D., et al. Recombination analysis of bacterial heredity. Cold Spring Harbor symposia Quantitative Biol. 1951;16:413-43.
  2. Duckworth DH. "Who Discovered Bacteriophage?". Bacteriology Reviews. 1976;40:793-802.
  3. Yap ML, Rossman, M.G. Structure and Function of Bacteriophage T4. Future Microbiol. 2014;9:1319-27.
  4. Sulakvelidze A, Alavidze, Z., Morris, J. G. Bacteriophage Therapy Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2001;45(3):649-59.
  5. Moore S. Sauer:P1vir phage transduction 2010 [Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction].
  6. Kobayashi A, et al. Growth Phase-Dependent Expression of Drug Exporters in
  7. Escherichia coli and Its Contribution to Drug Tolerance. Journal of Bacteriology. 2006;188(16):5693-703.
  8. Rocha D, Santos, CS, Pacheco LG. Bacterial reference genes for gene expression studies by RT-qPCR: survey and analysis. Antonie Van Leeuwenhoek. 2015;108:685-93.
  9. Pálffy R. et al. Bacteria in gene therapy: bactofection versus alternative gene therapy. Gene Ther. 2006 13:101-5.
  10. O'Neill JM, et al. Intestinal delivery of non-viral gene therapeutics: physiological barriers and preclinical models. Drug Discovery Today. 2011;16:203-2018.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter