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ファージトランスダクション
 

ファージトランスダクション:アンピシリン耐性をドナーからレシピエント大腸菌に伝達する方法

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細菌は、遺伝物質を交換することによって、急速に変化する環境に迅速に適応することができ、彼らはそれを行うことができる一つの方法は、トランスダクション、細菌ウイルスによって媒介される遺伝物質の交換です。バクテリオファージは、しばしばファージと略されるが、最初に宿主の表面に付着し、そのDNAを細菌細胞に注入することによって細菌に感染するウイルスの一種である。その後、宿主細胞自身のDNAを分解し、ウイルスゲノムを複製し、細胞の機械を乗っ取ってタンパク質の多くのコピーを合成します。これらのファージタンパク質は、自己組み立て、複数の子孫を形成するためにファージゲノムをパッケージ化します。しかし、DNA包装機構の忠実度が低いため、時折、ファージは細菌DNAの断片をファージカプシドにパッケージ化する。宿主の逆化を誘導した後、ファージ子孫が放出され、そのようなファージが別の宿主細胞に感染すると、前の宿主のDNA断片が伝達される。これは、再結合し、新しい宿主の染色体に永久に組み込まれ、それによって2つの細菌間の遺伝子伝達を媒次化することができる。

実験室でファージトランスダクションを行うには、目的の遺伝子を含むドナー株、それを欠くレシピエント株、両方の菌株に感染しうるファージ、およびトランスメーション細菌を選択する方法が必要です。ほとんどの場合、これは、トランスネクスト細菌の増殖をサポートするが、非トランスネクストされたものの成長を阻害する選択的固体成長培地になります。まず、目的の遺伝子を含むドナー株は、液体成長培地で培養される。すべての細菌が成長のログ段階で活発に分裂している場合、培養は標的ファージに接種される。インキュベーションの3〜4時間後、ほぼすべての細菌がファージ粒子をlyslyseおよび放出した場合、ドナーファージリサートは、レシピエント細菌株の新たに成長した培養物に接種される。1時間の短いインキュベーションの後、培養物は、現在、トランスネクストおよび非トランスネクスト細菌細胞の混合物を含むべきであり、これは適切な選択的固形成長培地に懸濁液の一部を広げることによって、トランスネク下細胞についてスクリーニングされる。さらなるインキュベーションの際に、トランスネクテーションされた細胞は成長し、増加し、目に見えるコロニーを得る必要があります。これらのコロニーは、コロニーPCR、DNAシーケンシング、定量PCRなどの正常な伝達をさらに確認するために、様々な方法を用いてさらなる分析のために選択することができる。

手順を開始する前に、ラボコートや手袋を含む適切な個人用保護具を着用してください。次に、70%のエタノールでワークスペースを殺菌し、表面を拭き取ります。

この後、LB塩溶液の3つの1ミリリットルのアリコートを調製する。さて、5ミリリットルのLB成長培地を5ミリリットルのLB成長培地を含む15ミリリットルの円錐バイアルに100マイクロリットルの大腸菌を500マイクログラムのアンピシリンで添加してドナー株培養を調製する。その後、通気と220 rpmで振って、摂氏37度で一晩培養を成長させます。翌日、70%のエタノールでベンチトップを拭き取ってから、振るインキュベーターから培養を取り除きます。次に、塩溶液を添加した新鮮なLBの990マイクロリットルにドナー株の10マイクロリットルを加えることによって100に一晩培養を希釈する。

細菌希釈を37°Cで2時間、通気と220rpmで振るようにします。細胞が早期ログ相に達したら、インキュベーターから培養物を取り出し、40マイクロリットルのP1ファージを培養に加え、再度インキュベートする。培養がリズされるまで1~3時間細胞を監視し続けます。次に、50~100マイクロリットルのクロロホルムをリサートに加え、渦で混ぜます。その後、ライサートを遠心分離して破片を除去し、上清を新鮮なチューブに移します。上清に数滴のクロロホルムを加え、1日以上摂氏4度に保存します。

経誘導手順を開始するには、レシピエント株の1ミリリットル培養物を得る。次に、100マイクロリットルのドナーファージリザートを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、キャップを30分間開けて37°Cでインキュベートし、残りのクロロホルムを蒸発させます。ドナーファージがインキュベートする間、ペレットは穏やかな遠心分離を介して細胞を歪める。上清を廃棄し、硫酸100ミリモルマグネシウムと5ミリモルカルシウム塩化カルシウムを含む新鮮なLBの300マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁します。

次に、レシピエント株の100マイクロリットルとドナーファージリサートの100マイクロリットルをマイクロ遠心管に組み合わせて経誘導反応を設定する。次いで、レシピエント株の100マイクロリットルとLBの100マイクロリットルを硫酸マグネシウム及び塩化カルシウムと組み合わせて負の対照を設定する。インキュベーション後、クチン酸1モルナトリウム1ミリリットルとLB1ミリリットルを両管に加え、上下にゆっくりと配管して混ぜます。その後、チューブを1時間インキュベートした後、遠心分離を介して細胞を穏やかにペレットする。

遠心分離後、上清を廃棄し、100ミリモルクチン酸で100マイクロリットルのLBでペレット化した細胞を再懸濁する。溶液を渦にし、1Xアンピシリンを含むLB寒天プレートにトランスメ下サンプル全体をピペットします。最後に、アンピシリンなしでLB寒天プレートに負の対照細胞混合物の全容積をピペットする。37°Cで一晩プレートをインキュベートした後、無菌ピペットチップを使用して、トランスダクションプレートから3~4個のコロニーを選び、1Xアンピシリンと1モルクチン酸100マイクロリットルを含む新しいLB寒天プレートにストリークします。1つのモルクチン酸の100マイクロリットルのみを含む別のLB寒天プレート上の負の対照のためのこのめっき方法を繰り返します。その後、一晩37°Cでプレートをインキュベートし、ファージのないコロニーが成長できるようにします。

翌日、70%のエタノールでベンチトップを拭き取ってから、インキュベーターからプレートを取り出します。滅菌ピペットチップを使用して、トランスダクションプレートから3つのコロニーを選び、それぞれ5ミリリットルのLB培地を含む別々のチューブに追加します。次に、負の制御プレートから3つのコロニーを選択し、LB培地の5ミリリットルを含む別のチューブに追加します。220 rpmで通気と揺れで摂氏37度で一晩培養を成長させます。前に示したようにベンチトップを殺菌した後、DNAミニプレップキットを使用して、製造元の指示に従って各培養物の4.5ミリリットルからDNAを分離します。次いで、35マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でDNAを溶出し、ラボ分光光度計で得られた濃度を測定します。最後に、100%グリセロールの0.5ミリリットルに両方の細菌溶液の残りの0.5ミリリットルを追加することにより、グリセロールストックを調製します。

経電を確認するには、まず24個のqPCR反応に対して2つのqPCRマスターミックスを調製します。最初のマスターミックスでは、150マイクロリットルのqPCRバッファーミックスをマイクロ遠心管に加え、アンピシリン耐性遺伝子を増幅するように設計されたフォワードとリバースプライマーのそれぞれに12マイクロリットルを加えます。次に、マイクロ遠心管に150マイクロリットルのqPCRマスターミックスを加え、ハウスキーピング遺伝子を増幅するように設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーのそれぞれ12マイクロリットルを追加して、第2のqPCRマスターミックスを準備します。

各qPCR反応について、各反応から100マイクログラムの実験DNAを14.5マイクロリットルのqPCRマスターミックスと組み合わせます。さて、前に示したように残りの反応を準備します。94°Cに予熱されたサーモサイクラーに反応を転送し、プログラムを開始します。最後に、qPCRによって生成されたサイクル定量(Cq)値を使用して、アンピシリン耐性遺伝子の正規化されたトランスダクション効率を計算します。

対象遺伝子のサイクル定量(Cq)値は、各陰性対照およびトランスネクテッドサンプルについて集計された。低いCq値は、通常29サイクル未満で、この例のトランス下サンプルのように、ターゲット配列の高量を示す。

ハウスキーピング遺伝子は、ここでも集計され、各反応におけるDNAの量を正規化するためのローディングコントロールとして、またqPCRが働いていることを確実にするための陽性対照として使用される。同じ量のハウスキーピング遺伝子がロードされている場合、各サンプルにおいて比較的同じ速度で見出される。

次に、各サンプルのデルタCq値を算出し、対応する標的遺伝子のCq値から各サンプルのハウスキーピング遺伝子のCq値を減算する。たとえば、最初の負のコントロールのデルタ Cq は 13.54 です。次に、この値を使用して、ここに示す式を使用して、各サンプルの正規化されたトランスダクション効率を計算します。最後に、各サンプル群の平均正規化トランスダクション効率を算出することができる。

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