Overview
Fonte: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 e Katja Brückner1,2,3
1 Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
2 Departamento de Biologia Celular e Tecidual,
3 Instituto de Pesquisa Cardiovascular, Universidade da Califórnia São Francisco, São Francisco, CA, EUA
Amplificação rápida de extremidades cDNA (RACE) é uma técnica que permite a amplificação de cDNA de comprimento completo de mRNA estendendo-se até o final de 3' ou 5', mesmo sem conhecimento prévio da sequência (Frohman et al., 1988). Em contraste com o PCR regular, ele usa apenas um primer PCR específico e um segundo primer não específico que se ligará indiscriminadamente à maioria dos mRNAs. Dependendo se a área a ser amplificada estiver na extremidade de 3' ou 5' do mRNA, o segundo primer é escolhido para ligar a cauda poliA (extremidade de 3' ou um linker sintético adicionado a todas as transcrições (final de 5'). Essas combinações de primer são conhecidas por produzir PCR "unilateral" ou "ancorado" devido à amplificação do PCR usando a sequência conhecida de um lado- 3' ou 5'(Ohara et al., 1989). A abordagem permite a captura de mRNAs raras específicas de genes que de outra forma seriam difíceis de detectar, por exemplo, devido à sua expressão relativamente baixa ou sequência completa desconhecida (Frohman et al., 1988).
RACE é iniciado com uma etapa de transcrição reversa (RT) para sintetizar DNA de cortesia único encalhado (cDNA) do mRNA. Isso é seguido por dois PCRs consecutivos que amplificam os fragmentos de CDNA de um gene de interesse. Para realizar o RACE, a sequência do gene de interesse deve ser pelo menos parcialmente conhecida, pois é necessário projetar os primers específicos de genes (GSPs; Frohman, 1994; Liu e Gorovsky, 1993). Como o segundo par de primer é um primer genérico que será anneal para todas as transcrições presentes na amostra, a especificidade das reações pcr é reduzida. A RACE é, portanto, idealmente realizada com dois PCRs aninhados para diminuir as chances de amplificar transcrições não específicas (Figura 1). Dependendo da direção da amplificação em relação ao GSP, a técnica é categorizada como CORRIDA de 5' ou 3' (Figura 1).
3' RACE (Figura 1A) aproveita a cauda poli(A) presente em mRNAs como um local de ligação genérico para o primer não específico. Isso simplifica a técnica, pois pode-se sintetizar cDNA usando primers oligo (dT). Os GSPs estão localizados na região de 5' das transcrições. Esta variante RACE permite a detecção de variantes de transcrição e UTRs diferentes de 3' (Scotto Lavino et al., 2007a). Na CORRIDA de 5' (Figura 1B), os GSPs estão localizados na região de 3' do gene. Para poder usar um primer não específico que se liga a todas as transcrições, um adaptador que serve como site de ligação de primer genérico é anexado às extremidades do RNA de 5'. Para anexar o adaptador ao mRNA, a tampa de 5' que protege mRNAs contra exonucleases e promove a tradução deve ser removida (Bird et al., 2016). Ao contrário da CORRIDA de 3'' RACE, a CORRIDA de 5' ajuda a encontrar variantes diferenciais de 5' e UTRs alternativas de 5' (Scotto Lavino et al., 2007b).
Aqui realizaremos 3' RACE para identificar e isolar diferentes variantes de transcrição usando a sequência conhecida de 5' (Figura 2A) codificada pelo gene Drosophila dSmad2 (Smox). dSmad2, uma proteína Smad mosca, é um importante transdutor de sinalização Activin-β, um caminho da superfamília TGF-β. dSmad2 regula múltiplos processos celulares, como proliferação celular, apoptose e diferenciação (Upadhyay et al., 2017). Como transcrições diferencialmente emendadas de dSmad2 podem ter funções diferentes na mosca adulta, um primeiro passo na exploração dessas funções potenciais é avaliar todas as variantes de transcrição do dSmad2 nesta fase de desenvolvimento.
Procedure
1. Experimento configurado para corrida de 3'
- Projete um primer específico de 5' para um gene de interesse (primer específico de genes 1, GSP-1). Deve ser altamente específico, pois é a única cartilha que introduz especificidade. Portanto, uma cartilha relativamente longa seria preferível (comprimento típico em torno de 24 nucleotídeos, Tm variando de 55-65°C).
- Projete uma segunda primer aninhada (GSP-2), ou seja, a cartilha deve estar localizada a 3' de GSP-1. Esta etapa é opcional, mas realizar um segundo PCR com uma cartilha aninhada aumentará o rendimento e a especificidade do PCR para o gene de interesse. Os primers usados para amplificar dSmad2 cDNAs estão listados na Tabela 2.
2. Síntese de cDNA
- Extrair RNA de amostras, utilizando um método de extração de RNA ou kit seguindo o protocolo do fabricante. Trate as amostras com DNase para evitar a amplificação do DNA genômico. Em nosso exemplo, extraímos RNA de 10 moscas adultas inteiras.
- Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume e ajuste com água livre de RNase até um máximo de 100 ng/μl, se necessário.
- Prepare o cDNA em uma reação de transcrição reversa (RT), usando um kit recomendado para RACE. Prepare uma mistura mestra, com os seguintes reagentes por amostra:
- 4 μl Tampão de transcrição reversa (5x)
- 2 μl Oligo(dT)20 primer (um oligo composto por 20 desoxidinadinas)
- 10 μl RNA (máx. 1 μg)
- 3 μl ddH2O
- 1 μl transcriptase reversa
- TOTAL: 20 μl - Incubar a reação por 90 min a 42ºC. Inclua um controle negativo omitindo transcriptase reversa.
- Inative a transcriptase reversa incubando a 85ºC por 5 min.
- Para diluir os níveis de DNA para PCR eficiente, adicione 80 μl de te buffer para levar o volume total a 100 μl.
3. Amplificação de fragmentos de cDNA
- Prepare o mix pcr de amplificação de primeira rodada usando uma polimerase Taq de alta fidelidade (HF):
- 4 μl 5x HF Taq tampão de polimerase
- 0,4 μl dNTP mix (10 mM cada)
- 1 μl GSP1 primer (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
- 1 modelo cDNA μl
- 0,2 μl HF Taq DNA polimerase
- 12,4 μl ddH2O
- Total: 20 μl - Execute o PCR usando o programa PCR1 (Tabela 1). Inclua um controle negativo usando como modelo o produto RNA original sem RT. Além disso, um controle "sem primer" pode ser incluído.
- Opcional: PCR aninhado para aumentar a especificidade e a quantidade de produtos cDNA. Diluir 1 μl dos produtos PCR e controle negativo 1:20 no buffer TE. Use-os como modelo para as segundas reações do PCR:
- 4 μl 5x HF Taq tampão de polimerase
- 0,4 μl dNTP mix (10 mM cada)
- 1 μl GSP2 primer (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
- 1 modelo de produto PCR de 1 μl
- 0,2 μl HF Taq DNA polimerase
- 12,4 μl ddH2O
- Total: 20 μl - Execute o segundo PCR usando o programa PCR2 (Tabela 1)
4. Isolamento de fragmentos de CDNA
- Prepare um gel de 1-2% de agarose com tampão TAE, usando brometo de ethidium ou uma mancha alternativa de DNA.
- Misture 5 μl de amostra com 1 μl de tampão de carga de gel de 6x.
- Carregue as amostras e a escada de DNA de 1kb como marcador e execute o gel a 120 V por cerca de 45 minutos ou até que a frente de corante seja ~75% do caminho para baixo do gel. Certifique-se de que as amostras não saiam do gel.
- Verifique as bandas de gel sob uma lâmpada UV. Para posterior processamento dos produtos, use UV de baixa intensidade, localize as bandas amplificadas e corte-as do gel usando um bisturi.
- Purifique o DNA do gel usando um método como freeze-squeeze ou um kit.
- Armazene os fragmentos de cDNA purificados a -20ºC ou use-os imediatamente para outras aplicações, como sequenciamento ou clonagem.
Normalmente, com mRNAs novelas apenas uma parte de sua sequência completa é conhecida. As sequências de nucleotídeos ausentes nas extremidades do mRNA podem ser determinadas usando um método baseado em PCR chamado Amplificação Rápida de extremidades cDNA, ou RACE.
Nos eucariotes, mRNAs maduros têm características estruturais distintas em ambas as extremidades. Na extremidade cinco-prime, a maioria tem um resíduo de guanosina metilado conectado ao mRNA através de uma ligação triphosfato de cinco prime a cinco prime. Isso também é conhecido como o boné cinco-prime. No final de três prime, a maioria dos eucariotes tem uma cauda de 20 a 250 resíduos de adenílato, chamado de cauda poli(A).
Agora, se a sequência nucleotídea de um pequeno segmento é conhecida em qualquer lugar dentro do mRNA, a sequência até a extremidade três-prime pode ser amplificada usando um primer específico de genes e um primer oligo (dT) não específico que se acotoda à cauda poli(A) na extremidade três-prime. Este subconjunto da técnica RACE é chamado de RACE de três primos, e permite a detecção de variantes de transcrição e diferentes regiões não traduzidas de três primos, ou UTRs.
A sequência na extremidade cinco-prime pode ser amplificada da mesma forma. Para fazer isso, uma cauda poli(A) é primeiramente anexada na extremidade cinco-prime. Em seguida, usando uma cartilha oligo (dT) não específica que se acotoda à cauda anexada e a um primer específico para genes, a sequência até a extremidade de cinco primes pode ser amplificada. Este subconjunto de RACE é conhecido como RACE cinco-prime e é usado para encontrar variantes diferenciais de emendas cinco prime e UTRs alternativas cinco prime.
Para realizar o TRI-PRIME para identificar diferentes transcrições codificadas por um determinado gene, o RNA é primeiro isolado do organismo ou tecido de interesse. Em seguida, o cDNA é sintetizado a partir dos mRNAs isolados com uma reação de transcrição reversa que utiliza uma primer oligo (dT) e uma enzima transcriptase reversa, que gera DNA complementar a partir de um modelo de RNA. Em seguida, a partir do pool gerado de cDNAs, a extremidade de três primes desconhecida do CDNA é estendida via PCR, utilizando o primer oligo (dT) não específico e um primer específico para genes, e amplificado durante a reação do PCR.
No entanto, devido à natureza genérica do primer não específico e ao erro aleatório do primer específico do gene, eles podem se agrater aos cDNAs fora do alvo, fazendo com que eles ampliem também. Para superar esse problema, uma segunda rodada de PCR é realizada usando primers aninhados, que ligam a jusante do primeiro conjunto de primers. Este segundo conjunto de primers amplifica ainda mais o cDNA de interesse, mas não o produto não específico, aumentando a especificidade e o rendimento da reação.
Finalmente, os produtos PCR são separados usando eletroforese de gel agarose, que separa diferentes transcrições do gene alvo com base em seus tamanhos, produzindo bandas distintas. A faixa de interesse pode então ser extirpada, purificada e finalmente sequenciada para obter a sequência completa da transcrição.
Neste vídeo, demonstraremos a técnica RACE de três primos para identificar e isolar diferentes transcrições codificadas pelo gene Drosophila dSmad2.
Antes de iniciar a síntese e amplificação do cDNA, use um software de design de primer para criar um primer específico de cinco primes para o gene de interesse, dSmad2 neste exemplo. Para garantir que o primer seja altamente específico, ele deve ser em torno de 24 nucleotídeos e ter um Tm variando de 55 a 65 graus Celsius. Em seguida, projete uma segunda cartilha aninhada localizada três prime da primeira primer, que também é específica para a sequência de destino.
Para começar, extraia RNA de 10 moscas adultas inteiras com um kit de extração de RNA comercialmente disponível. Uma vez extraído o RNA, resuspenja a pelota em 20 microlitres de água sem nuclease. Para uma reação de 50 microliteres, adicione 5 microliters do buffer de reação a cada tubo de amostra, e traga o volume da reação adicionando 24 microliters de água sem nuclease. Em seguida, adicione 1 microliter de DNase I para evitar a amplificação do DNA genômico. Por fim, incubar as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Após o tratamento de DNase, inativar a enzima com 1 microliter de 25 mililitros EDTA em cada um dos tubos. Adicione a amostra a uma coluna de spin para purificar o RNA. Em seguida, use um espectrofotômetro de microvolume para medir a concentração de RNA. Ajuste a concentração para 100 nanogramas por microlitera adicionando água sem nuclease.
Agora, prepare uma mistura mestra para a reação de transcrição reversa. Além das amostras de DNA do teste, incluem um controle negativo omitindo transcriptase reversa do tubo apropriado. Incubar as reações por 90 minutos a 42 graus Celsius. Em seguida, inativar a transcriptase reversa incubando os tubos a 85 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, diluir os níveis de DNA adicionando 80 microliters de tampão de TE a cada tubo para trazer a reação total para 100 microliters.
Agora que o cDNA está sintetizado, amplie o gene de interesse via PCR. Para isso, prepare primeiro o mix pcr de amplificação da primeira rodada. Além do modelo cDNA, inclua uma reação de controle negativa que usa o modelo do produto não transcrito reverso, bem como uma reação que não tem o primer específico do gene como um controle sem primer.
Uma vez que as reações sejam preparadas, realize amplificações de PCR em um termociclador equipado com uma tampa aquecida. Em seguida, diluir os produtos de 1 a 20 adicionando 1 microliter dos produtos PCR a 19 microliters de tampão te. Utilizando estes produtos diluídos, prepare o mix pcr de amplificação de segunda rodada. Em seguida, use um termociclador para executar o segundo PCR.
Para isolar os fragmentos de PCR, prepare um gel de 1% de agarose adicionando 1 grama de agarose por 100 mililitros de tampão TAE. Derreta a mistura por dois minutos no micro-ondas e, em seguida, adicione mancha SYBR Safe ou brometo de etídio. Despeje a mistura derretida em uma bandeja de gel e deixe-a definir.
Enquanto o gel está configurando, pipeta 1 microliter gotículas de 6X Loading Dye em um pedaço de parafilm correspondente ao número de amostras. Adicione 5 microliters de amostra a cada gota. Agora, carregue as amostras, junto com uma escada de DNA de 1 quilobase, no gel. Execute o gel a 120 volts por aproximadamente 45 minutos ou até que a frente de corante seja 75% do caminho para baixo do gel.
Quando o gel terminar de funcionar, verifique as bandas de gel sob um transilluminator UV. Localize as bandas e corte-as usando um bisturi. Purifique os fragmentos de cDNA usando um kit de coluna de spin disponível comercialmente. Uma vez purificados, os fragmentos de cDNA podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius ou usados imediatamente para análise posterior.
Antes deste experimento, duas transcrições para Drosophila dSmad2 foram anotadas no banco de dados genômico Drosophila, FlyBase. Com base no emendamento esperado deste gene, dois produtos devem ser identificados pelo protocolo RACE três-prime.
Os resultados deste experimento, no entanto, revelam três transcrições diferentes para dSmad2. Entre os produtos previstos, uma transcrição é predominante, e uma é expressa em um nível mais baixo. Além disso, foi detectado um produto menor não-inscrito anteriormente, visível em 750 pares de bases.
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Results
Há duas transcrições anotadas para Drosophila dSmad2 em FlyBase (Fig. 2A). Nossos resultados, no entanto, revelam três transcrições diferentes para dSmad2, variando em tamanho de 750 bp a 1400 bp (Fig. 2B). Diferenças na intensidade das bandas indicam seus níveis relativos de expressão. Entre os produtos previstos, uma transcrição é predominante (Fig. 2B, seta preta A), e uma é expressa em nível inferior (Fig. 2B, seta preta B). Além disso, foi detectado um produto menor não atribuído anteriormente (Fig. 2B, seta cinza C).
A identificação de transcrições tão raras só é possível com um método sensível como o RACE. Após RACE, pode-se clonar os fragmentos obtidos pelo PCR para estudar a sequência de transcrição, encontrar sua semelhança com outras variantes de transcrição e cloná-lo para transgênese. Tais experimentos ajudam a investigar as funções de variantes de transcrição específicas de um tecido ou estágio de desenvolvimento.
Figura 1. Esquemas das duas abordagens race diferentes. A) CORRIDA DE 3'' cDNA é sintetizado usando primers oligo (dT). O mesmo primer oligo (dT) é usado em combinação com um primer específico de 5' genes para amplificar extremidades de 3' cDNA através de uma, ou melhor, duas rodadas de PCR. B) CORRIDA DE 5'' . RNA é primeiro decappedado para liberar o final de 5''. Em um segundo passo, uma sequência de RNA adaptador é adicionada ao final de 5'. cDNA é gerado usando um primer complementar à sequência do adaptador. O mesmo primer é usado em combinação com primer/s específicos de 3' genes para amplificar o cDNA.
Figura 2. A) A CORRIDA permite a amplificação de várias transcrições do mesmo gene, exemplificadas por 3' RACE of Drosophila dSmad2. A combinação de um primer não específico (Oligo dT) com um primer específico para genes (GSP) produz cDNAs de diferentes comprimentos (Produto A, Produto B) correspondentes a transcrições emendadas alternativamente (mRNA A, mRNA B). B) Separação de produtos PCR de dSmad2 3' RACE em um gel de 1% de agarose. As faixas correspondem a (1) 1 kb escada de DNA como marcador, (2) sem controle negativo RT (contém RNA e primers), (3) sem primers controle negativo (contém modelo cDNA) (4) reação completa de 3' RACE para dSmad2 (contém. primers e modelo cDNA). A amplificação das transcrições dSmad2 por 3' RACE rende três produtos distintos (setas). Dois cDNAs foram de tamanhos previstos em torno de 1400 e 1200bp (setas pretas A e B, correspondentes ao Produto A e B em (A)). Além disso, foi detectado um cDNA menor não-atribuído anteriormente de ~750bp (seta cinza, C).
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Applications and Summary
O RACE fornece uma ferramenta rápida, barata e poderosa para obter cDNAs de sequências que são apenas parcialmente conhecidas, ou de transcrições raras que são de outra forma mais difíceis de amplificar. Ele pode ser usado para encontrar a sequência de transcrições desconhecidas de um gene já conhecido ou para clonar tais transcrições para estudos posteriores. Após o RACE, essas transcrições podem ser superexpressas em sistemas baseados em células ou organismos modelo para investigar sua função in vivo.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciência # IOS-1355222 e dos Institutos Nacionais de Saúde # 1R01GM112083 e 1R01GM131094 (para K.B.).
References
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