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cDNA 말단의 신속 증폭

Overview

출처: 파블로 산체스 보쉬2,숀 코코란2, 카타 브뤼크너1,2,3
1 엘리와 에디테 브로드 재생 의학 및 줄기 세포 연구 센터
2 세포 및 조직 생물학학과,
3 미국 캘리포니아 주 샌프란시스코 대학교 심장혈관 연구소

cDNA 끝(RACE)의 신속한 증폭은 시퀀스에 대한 사전 지식 없이도 3' 또는 5'끝으로 확장하여 mRNA로부터 전신 cDNA를 증폭할 수 있는 기술이다(Frohman et al., 1988). 일반 PCR과는 달리, 그것은 단지 하나의 특정 PCR 프라이머와 대부분의 mRNA에 무차별 적으로 바인딩됩니다 두 번째 비 특이적 프라이머를 사용합니다. 증폭되는 영역이 mRNA의 3' 또는 5'끝에 있는지 여부에 따라, 두 번째 프라이머는 모든 성적증명서(5'end)에 추가된 폴리A 꼬리(3'end) 또는 합성 링커를 결합하도록 선택된다. 이러한 프라이머 조합은 한쪽-3 또는 5'(오하라 외, 1989)의 공지된 시퀀스를 사용하여 PCR 증폭으로 인해 "일방적" 또는 "고정된" PCR을 산출하는 것으로 알려져 있다. 접근은 그렇지 않으면 검출하기 어려울 유전자 특정 희귀 mRNAs의 포착을 허용합니다, 예를 들면 그들의 상대적으로 낮은 발현 또는 알려지지 않은 완전한 순서 때문에 (Frohman et al., 1988).

RACE는 mRNA로부터 단일 좌초 된 무료 DNA (cDNA)를 합성하기 위해 역 전사 단계 (RT)로 시작됩니다. 이것은 관심있는 유전자에서 cDNA 단편을 증폭시키는 2개의 연속PCRs에 선행됩니다. RACE를 수행하기 위해서는, 관심 있는 유전자의 서열은 유전자 특이적 프라이머(GSPs)를 설계하는 데 필요한 바와 같이 적어도 부분적으로 알려져야 합니다. 프로만, 1994년; 리우와 고로프스키, 1993년). 두 번째 프라이머 쌍은 샘플에 존재하는 모든 성적체에 대한 음침을 줄이는 일반 프라이머이기 때문에 PCR 반응의 특이성이 감소됩니다. 따라서 RACE는 비특이적 성적증명서를 증폭할 확률을 낮추기 위해 중첩된 두 개의 PCR로 이상적으로 수행됩니다(그림 1). GSP에 비해 증폭방향에 따라 이 기술은 5' 또는 3'RACE(도 1)로 분류됩니다.

3' RACE(도 1A)는 mRNA에 존재하는 폴리(A) 꼬리를 비특이적 프라이머에 대한 제네릭 결합 부위로 활용한다. 이것은 oligo (dT) 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성 할 수 있기 때문에 기술을 단순화합니다. GSP는 성적 증명서의 5'영역에 위치하고 있습니다. 이 RACE 변종은 성적 증명서 변형및 다른 3'UTR (스코토 라비노 등, 2007a)의 검출을 허용합니다. 5'RACE (도 1B)에서, GSPs는 유전자의 3'영역에 위치합니다. 모든 성적증명서에 결합하는 비특이적 프라이머를 사용할 수 있도록 일반 프라이머 결합 부위역할을 하는 어댑터가 5'RNA 끝에 부착된다. mRNA에 어댑터를 부착하려면 외핵체로부터 mRNA를 보호하고 번역을 촉진하는 5'캡을 제거해야 합니다(Bird et al., 2016). 3'RACE에 반대, 5'RACE는 차동 5의 스플라이스 변형과 대안 5'UTR (스코토 라비노 등, 2007b)를 찾는 데 도움이됩니다.

여기에서 는 드로소필라 dSmad2 (Smox)유전자에 의해 인코딩된 공지된 5' 서열(그림 2A)을 사용하여 상이한 성적증명서 변이체를 식별하고 격리하기 위해 3'RACE를 수행합니다. dSmad2, 플라이 스마드 단백질, 액티빈 β 신호의 중요 한 변환기, TGF-β 슈퍼 패밀리의 경로. dSmad2는 세포 증식, 세포 세포 증식 및 분화와 같은 다중 세포 과정을 조절합니다(Upadhyay et al., 2017). dSmad2의 차분하게 접합된 성적증명서가 성인 비행에서 다른 기능을 가질 수 있기 때문에, 이러한 잠재적 기능을 탐구하는 첫 번째 단계는 이 발달 단계에서 dSmad2의 모든 성적 증명서 변형을 평가하는 것입니다.

Procedure

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1. 3'RACE에 대한 실험 설정

  1. 관심 유전자(유전자 특이적 프라이머 1, GSP-1)에 대한 5' 특정 프라이머를 설계한다. 특이성을 도입하는 유일한 프라이머이기 때문에 매우 구체적이어야 합니다. 따라서, 상대적으로 긴 프라이머가 바람직할 것이다(55-65°C에서 24개의 뉴클레오티드, Tm의 전형적인 길이).
  2. 두 번째 중첩 프라이머(GSP-2)를 설계하는 것은, 즉 프라이머는 GSP-1의 3'에 위치해야 한다. 이 단계는 선택 사항이지만 중첩 된 프라이머로 두 번째 PCR을 수행하면 관심 유전자에 대한 PCR의 수율 및 특이성을 증가시게됩니다. dSmad2 cDN을 증폭시키는 데 사용되는 프라이머는 표 2에 나열됩니다.

2. cDNA 합성

  1. 제조자의 프로토콜에 따라 RNA 추출 방법 또는 키트를 사용하여 샘플에서 RNA를 추출한다. 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위해 DNase로 샘플을 치료하십시오. 우리의 예에서, 우리는 10 전체 성인 파리에서 RNA를 추출했습니다.
  2. 마이크로볼륨 분광계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 필요한 경우 RNase 프리 워터로 최대 100 ng/μl으로 조정합니다.
  3. RACE에 권장되는 키트를 사용하여 역전사(RT) 반응으로 cDNA를 준비합니다. 샘플당 다음 시약으로 마스터 믹스를 준비합니다.
    - 4 μl 역 전사 버퍼 (5x)
    - 2 μl 올리고 (dT)20 프라이머 (20 데옥시티닌으로 구성된 올리고)
    - 10 μl RNA (최대 1 μg)
    - 3 μl ddH2O
    - 1 μl 역 전사제
    - 합계 : 20 μl
  4. 42ºC에서 90 분 동안 반응을 배양하십시오. 역 전사를 생략하는 네거티브 제어를 포함한다.
  5. 5 분 동안 85ºC에서 배양하여 역 전사를 비활성화합니다.
  6. 효율적인 PCR을 위해 DNA 수준을 희석시키기 위해 80 μl TE 버퍼를 추가하여 총 부피를 100 μl로 가져옵니다.

3. cDNA 단편 증폭

  1. 고충실도(HF) Taq 폴리머라제를 사용하여 1라운드 증폭 PCR 믹스를 준비하십시오.
    - 4 μl 5x HF 타크 폴리머라제 버퍼
    - 0.4 μl dNTP 믹스 (각 10mMM)
    - 1 μl GSP1 프라이머 (10 μM)
    - 1 μl 올리고 (dT)20 프라이머 (10 μM)
    - 1 μl cDNA 템플릿
    - 0.2 μl HF 타크 DNA 폴리머라제
    - 12.4 μl ddH2O
    - 합계 : 20 μl
  2. PCR1 프로그램(표 1)을 사용하여 PCR을 실행합니다. RT 없이 원래 RNA 제품을 템플릿으로 사용하여 음의 대조를 포함한다. 또한, '프라이머 없음' 컨트롤이 포함될 수 있다.
  3. 선택 사항: 중첩된 PCR을 통해 특이성과 cDNA 제품의 양을 증가시합니다. PCR 제품의 1 μl을 희석하고 TE 버퍼에서 음수 제어 1:20을 희석합니다. 두 번째 PCR 반응에 대한 템플릿으로 사용하십시오.
    - 4 μl 5x HF 타크 폴리머라제 버퍼
    - 0.4 μl dNTP 믹스 (각 10mMM)
    - 1 μl GSP2 프라이머 (10 μM)
    - 1 μl 올리고 (dT)20 프라이머 (10 μM)
    - 1 μl PCR 제품 템플릿
    - 0.2 μl HF 타크 DNA 폴리머라제
    - 12.4 μl ddH2O
    - 합계 : 20 μl
  4. PCR2 프로그램을 사용하여 두 번째 PCR 실행(표 1)

4. cDNA 단편 의 격리

  1. 에티듐 브로마이드 또는 대체 DNA 얼룩을 사용하여 1-2% 아가로즈 젤을 TAE 버퍼로 준비합니다.
  2. 샘플 5 μl을 6x 젤 로딩 버퍼 1μl과 혼합합니다.
  3. 시료와 1kb DNA 사다리를 마커로 적재하고 젤을 120 V에서 약 45분 동안 또는 염료 전면이 겔 아래로 내려가는 방식의 ~75%가 될 때까지 젤을 실행합니다. 샘플이 젤이 부족하지 않도록 하십시오.
  4. UV 램프 아래에서 젤 밴드를 확인합니다. 제품의 추가 처리를 위해, 낮은 강도 UV를 사용하여 증폭 된 밴드를 찾아 메스를 사용하여 젤에서 잘라.
  5. 동결 짜기 또는 키트와 같은 방법을 사용하여 젤에서 DNA를 정화합니다.
  6. 정제된 cDNA 조각을 -20ºC에 저장하거나 시퀀싱 또는 복제와 같은 추가 응용 프로그램에 즉시 사용하십시오.

일반적으로, 새로운 mRNA를 사용하면 전체 시퀀스의 일부만 알려져 있다. mRNA의 끝에 누락된 뉴클레오티드 서열은 cDNA 끝 또는 RACE의 신속한 증폭이라고 불리는 PCR 기반 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

진핵생물에서 성숙한 mRNA는 양쪽 끝에 독특한 구조적 특징을 가지고 있습니다. 5-프라임 엔드에서, 대부분은 5 프라임 triphosphate 연결에 5 프라임을 통해 mRNA에 연결된 메틸화 된 구노신 잔류물을 가지고있다. 이것은 또한 다섯 프라임 캡으로 알려져있다. 3 개의 프라임 엔드에서 대부분의 진핵생물은 폴리 (A) 꼬리라고 불리는 20 ~ 250 개의 아데닐레이트 잔류물을 가지고 있습니다.

지금, 작은 세그먼트의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 내 어디에나 공지되는 경우, 3-프라임 엔드까지의 서열은 유전자 특이적 프라이머와 3-프라임 엔드에서 폴리(A) 꼬리에 멸폐되는 비특이적 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. RACE 기술의 이 하위 집합은 3프라임 RACE라고 하며, 성적증명서 변형과 다른 3프라임 번역되지 않은 영역 또는 UTR을 검출할 수 있습니다.

5-프라임 엔드의 시퀀스는 유사하게 증폭될 수 있다. 이렇게 하려면 폴리(A) 꼬리가 5가지 프라임 엔드에 먼저 부착됩니다. 이어서, 비특이적 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 부속된 꼬리및 유전자 특이적 프라이머에 멸폐하는, 5-prime end까지의 서열이 증폭될 수 있다. RACE의이 하위 집합은 다섯 프라임 레이스로 알려져 있으며 차등 5 프라임 스플라이스 변형및 대체 5 프라임 UTR을 찾는 데 사용됩니다.

주어진 유전자에 의해 인코딩된 상이한 성적증명서를 확인하기 위해 3-프라임 RACE를 수행하기 위해 RNA는 먼저 관심 있는 유기체 또는 조직으로부터 분리된다. 다음으로, cDNA는 RNA 템플릿으로부터 보완적인 DNA를 생성하는 올리고(dT) 프라이머 및 역전사 효소를 활용하는 역전사 반응으로 격리된 mRNAs로부터 합성된다. 다음으로, 생성된 cDN의 풀에서, 표적 cDNA의 알려지지 않은 3-프라임 엔드는 PCR을 통해 확장되어 비특이적 올리고(dT) 프라이머와 유전자 특이적 프라이머를 활용하고, PCR 반응 중에 증폭된다.

그러나, 유전자 특정 입문서의 비특이적 입문서 및 무작위 실수의 일반적인 특성으로 인해, 그들은 오프 타겟 cDNA로 음막할 수 있어 증폭을 유발합니다. 이 문제를 극복하기 위해 첫 번째 프라이머 세트의 하류를 묶는 중첩 된 프라이머를 사용하여 두 번째 PCR 라운드가 수행됩니다. 프라이머의 이 두 번째 세트는 관심 있는 cDNA를 더욱 증폭시키지만 비특이적 제품이 아니라 반응의 특이성과 수율을 증가시다.

마지막으로, PCR 제품은 아가로즈 젤 전기포고증을 사용하여 분리되어 크기에 따라 표적 유전자의 상이한 성적증명서를 분리하여 뚜렷한 대역을 생성합니다. 관심의 밴드는 다음 절제, 정제, 마지막으로 전사자의 완전한 시퀀스를 얻기 위해 시퀀싱 할 수 있습니다.

이 비디오에서는 Drosophila dSmad2 유전자에 의해 인코딩 된 다른 성적 증명서를 식별하고 격리하는 세 가지 프라임 RACE 기술을 시연 할 것입니다.

cDNA의 합성 및 증폭을 시작하기 전에, 프라이머 설계 소프트웨어를 사용하여 관심 유전자에 대한 5가지 프라임 특이프라이머, dSmad2를 이 예에서 생성한다. 프라이머가 매우 구체적이도록 하려면 약 24개의 뉴클레오티드가 되어야 하며 55도에서 65도에 이르는 Tm이 있어야 합니다. 다음으로, 제1 프라이머의 3-프라임에 위치한 두 번째 중첩 프라이머를 설계하여 대상 시퀀스에 대해서도 특이적입니다.

시작하려면, 10 명의 전체 성인에서 RNA를 추출하여 시판되는 RNA 추출 키트로 날아갑니다. RNA가 추출되면, 뉴클레아제없는 물의 20 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 50 마이크로리터 반응의 경우 각 샘플 튜브에 반응 버퍼 5 마이크로리터를 추가하고 핵이 없는 물의 24마이크로리터를 추가하여 반응의 부피를 생성합니다. 그런 다음, 게놈 DNA의 증폭을 방지하기 위해 DNase I의 마이크로 리터 1개를 추가합니다. 마지막으로 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

DNase 치료 후 각 튜브에 25 밀리머 EDTA의 마이크로리터 1개로 효소를 비활성화합니다. RNA를 정화하기 위해 샘플을 스핀 컬럼에 추가합니다. 다음으로, 마이크로볼륨 분광계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. 핵이 없는 물을 추가하여 마이크로리터당 100 나노그램으로 농도를 조절합니다.

이제 역전사 반응에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 시험 DNA 샘플 외에도 적절한 튜브에서 역전사를 생략하여 하나의 음의 대조를 포함한다. 섭씨 42도에서 90분 동안 반응을 배양합니다. 그런 다음, 5 분 동안 85섭씨에서 튜브를 배양하여 역 전사를 비활성화합니다. 다음으로, 각 튜브에 80 마이크로리터의 TE 버퍼를 추가하여 DNA 수준을 희석시켜 100 마이크로리터에 반응 합계를 가져옵니다.

이제 cDNA가 합성되었으므로 PCR을 통해 관심 유전자를 증폭시하십시오. 이렇게하려면 먼저 첫 번째 라운드 증폭 PCR 믹스를 준비하십시오. cDNA 템플릿 외에도, 비역 전사 제품으로부터 템플릿을 사용하는 음성 제어 반응뿐만 아니라 유전자 특이적 프라이머를 무프라이머 대조군으로 갖지 않는 반응을 포함한다.

반응이 준비되면 가열 된 뚜껑이 장착 된 열순환기에서 PCR 증폭을 수행하십시오. 다음으로, 19 마이크로리터의 TE 버퍼에 PCR 제품의 마이크로리터 1을 추가하여 제품을 1~20으로 희석한다. 이러한 희석 된 제품을 사용하여 두 번째 라운드 증폭 PCR 믹스를 준비하십시오. 그런 다음 열순환기를 사용하여 두 번째 PCR을 실행합니다.

PCR 조각을 분리하려면 100 밀리리터당 아가로즈 1그램을 추가하여 1% 아가로즈 젤을 준비한다. 전자 레인지에서 2 분 동안 혼합물을 녹인 다음 SYBR 세이프 얼룩 또는 에티듐 브로마이드를 추가합니다. 용융 혼합물을 젤 트레이에 붓고 놓습니다.

젤이 설정되는 동안, 피펫 1 마이크로리터 액적은 6X 로딩 염료의 마이크로리터 방울을 샘플 수에 해당하는 파라필름 조각에 한다. 각 액적에 5 마이크로리터의 샘플을 추가합니다. 이제 1킬로베이스 DNA 사다리와 함께 샘플을 젤에 적재합니다. 젤을 약 45분 동안 120볼트로 또는 염료 전면이 젤 아래로 75%가 될 때까지 젤을 실행합니다.

젤이 달리기를 마쳤을 때 UV 트랜실루미나이터 아래에서 젤 밴드를 확인하십시오. 밴드를 찾아 메스를 사용하여 잘라냅니다. 시판되는 스핀 컬럼 키트를 사용하여 cDNA 조각을 정화합니다. 일단 정제되면, cDNA 단편은 영하 20도에서 저장하거나 추가 분석을 위해 즉시 사용될 수 있습니다.

이 실험에 앞서 드로소필라 dSmad2에 대한 두 개의 성적증명서가 드로소필라 게놈 데이터베이스인 FlyBase에 추가되었습니다. 이 유전자의 예상 접합에 기초하여, 2개의 제품은 3개의 프라임 RACE 프로토콜에 의해 확인되어야 합니다.

그러나 이 실험의 결과는 dSmad2에 대한 세 가지 다른 성적 증명서를 보여줍니다. 예측 된 제품 중, 하나의 성적 증명서가 우세하고, 하나는 낮은 수준에서 표현된다. 또한 750개의 베이스 쌍에서 볼 수 있는 이전에 설명되지 않은 작은 제품이 검출되었습니다.

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Results

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플라이베이스에서 드로소필라 dSmad2에 대한 두 개의 노이티드 성적 증명서가 있습니다 (도 2A). 그러나 우리의 결과는 750 bp에서 1400 bp (도 2B)에 이르는 크기에 이르기까지 dSmad2에대한 세 가지 다른 성적 증명서를 보여줍니다. 대역 의 강도의 차이는 상대식 수준을 나타냅니다. 예측된 제품 중, 하나의 성적증명서가 우세(도 2B, 검은 화살 A), 그리고 하나는 낮은 수준에서 표현된다(도 2B, 검은 화살 B). 또한, 이전에 설명되지 않은 작은 제품이 검출되었다(도 2B, 회색 화살표 C).

이러한 희귀 한 성적 증명서의 식별은 RACE와 같은 민감한 방법으로만 가능합니다. RACE 다음, 하나는 성적 증명서 순서를 연구하기 위해 PCR에 의해 얻은 조각을 복제 할 수 있습니다, 다른 성적 증명서 변이체와 유사성을 찾아 전년대에 대한 복제. 이러한 실험은 조직 또는 발달 단계에 특정 한 성적 증명서 이체의 기능을 조사하는 데 도움이됩니다.

Figure 1
그림 1. 두 개의 서로 다른 레이스의 회로도가 접근합니다. A) 3' 레이스. cDNA는 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 합성된다. 동일한 올리고(dT) 프라이머는 PCR의 1개 또는 더 나은 2라운드를 통해 3' cDNA 끝을 증폭시키기 위해 5' 유전자 특이적 프라이머와 함께 사용된다. B) 5' 레이스. RNA는 먼저 5'끝을 해방하기 위해 디캡된다. 두 번째 단계에서, 어댑터 RNA 서열이 5'끝에 추가된다. cDNA는 어댑터 서열에 대한 보완적인 프라이머를 사용하여 생성된다. 동일한 프라이머는 cDNA를 증폭시키기 위해 3'유전자 특이적 프라이머/s와 함께 사용됩니다.

Figure 2
그림 2. A) RACE는 드로소필라 dSmad2의3'RACE에 의해 예시된 동일한 유전자에서 여러 성적증명서의 증폭을 허용한다. 유전자 특이적 프라이머(Oligo dT)와 유전자 특이적 프라이머(Oligo dT)의 조합은 대안적으로 접합된 전사체(mRNA A, mRNA B)에 대응하는 상이한 길이(제품 A, 제품 B)의 cDNA를 산출한다. B) 1% 아가로즈 젤에 dSmad2 3'RACE의 PCR 제품의 분리. 차선은 마커로서 (1) 1 kb DNA 사다리, (2) RT 음성 제어(RNA 및 프라이머 포함), (3) 프라이머 음성 제어 없음(cDNA 템플릿 포함) (4) dSmad2에 대한 3'RACE의 전체 반응(프라이머 및 cDNA 템플릿 포함)에 해당한다. 3'RACE에 의한 dSmad2 성적증명서의 증폭은 세 가지 뚜렷한 제품(화살표)을 산출합니다. 두 개의 cDNA는 약 1400 및 1200bp (검은 화살표 A 및 B, 제품 A 및 B에 해당하는)의 예측 된 크기였다(A). 또한 이전에 설명되지 않은 작은 cDNA ~750bp가 검출되었습니다(회색 화살표, C).

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Applications and Summary

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RACE는 부분적으로만 알려진 시퀀스또는 증폭하기 어려운 희귀 한 성적 증명서에서 cDN을 얻을 수있는 빠르고 저렴하며 강력한 도구를 제공합니다. 그것은 이미 알려진 유전자에서 알 수 없는 성적 증명서의 순서를 찾거나 추가 연구를 위한 그 같은 성적증명서를 복제하기 위하여 이용될 수 있습니다. RACE 다음, 이러한 성적증명서는 세포 기반 시스템 또는 모델 유기체에서 과발현되어 생체 내에서 의 기능을 조사할 수 있다.

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Acknowledgments

이 작품은 국립 과학 재단 # IOS-1355222 및 국립 보건 원의 보조금에 의해 지원되었다 # 1R01GM112083 및 1R01GM131094 (K.B.).

References

  1. Bird, J.G., Zhang, Y., Tian, Y., Panova, N., Barvík, I., Greene, L., Liu, M., Buckley, B., Krásný, L., Lee, J.K., et al. (2016). The mechanism of RNA 5′ capping with NAD+, NADH and desphospho-CoA. Nature 535, 444–447.
  2. Frohman, M.A. (1994). On beyond classic RACE (rapid amplification of cDNA ends). PCR Methods Appl. 4, S40–S58.
  3. Frohman, M.A., Dush, M.K., and Martin, G.R. (1988). Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.a. 85, 8998–9002.
  4. Liu, X., and Gorovsky, M.A. (1993).  Mapping the 5′ and 3′ ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE). Nucleic Acids Res. 21, 4954–4960.
  5. Ohara, O., Dorit, R.L., and Gilbert, W. (1989). One-sided polymerase chain reaction: the amplification of cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5673–5677.
  6. Scotto Lavino, E., Du, G., and Frohman, M.A. (2007a). 3′ End cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1, 2742–2745.
  7. Scotto Lavino, E., Du, G., and Frohman, M.A. (2007b). 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1, 2555–2562.
  8. Upadhyay, A., Moss-Taylor, L., Kim, M.-J., Ghosh, A.C., and O’Connor, M.B. (2017). TGF-β Family Signaling in Drosophila. Cold Spring Harb Perspect Biol 9, a022152.

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