Isolatie en normalisatie van DNA dat crosslinked eiwitten bevat

Om te beginnen met de isolatie en normalisatie van DNA-bevattende cross-linked eiwitten, zuigt u de media op met behulp van een zuigpipet na alomtegenwoordigheid en SUMOylation-medicamenteuze behandeling. Spoel de cellen met ijskoude PBS voordat u 600 microliter DNAzol-reagens toevoegt. Roer de plaat langzaam op een trillend platform gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en voeg 0,3 milliliter 100% koude ethanol rechtstreeks aan de plaat toe.

Herhaal het roeren totdat ondoorzichtig nucleïnezuuraggregaat zichtbaar wordt. Breng vervolgens het cellysaat over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius bij 20.000 G.Na het opzuigen van het supernatant, was het nucleïnezuur en de verknoopte eiwitpellet in één milliliter 75% ethanol, gevolgd door twee minuten centrifugeren bij 20.000 G en vier graden Celsius. Zuig het supernatant aan voordat u met dezelfde snelheid naar beneden draait en de resterende vloeistof verwijdert met behulp van een P-20-pipet.

Droog de pellet vijf minuten aan de lucht. Los de gedroogde nucleïnezuurkorrel op in 0,1 milliliter dubbel gedestilleerd water door een paar keer op en neer te pipetteren. Incubeer vervolgens de suspensie bij 37 graden Celsius in een waterbad gedurende 30 minuten totdat de pellet minstens drie keer opzwelt.

Soniceer de monsters gedurende 10 seconden met behulp van een ultrasone processorsonde op 30% amplitude en kwantificeer de DNA-concentratie met behulp van een UV-Vis-spectrometer. Voeg dubbel gedestilleerd water toe om de concentratie van het DNA aan te passen tot 400 tot 500 nanogram per microliter in 120 microliter. Breng vervolgens 20 microliter van het monster over naar een nieuwe microcentrifugebuis als onverteerde DNA-belastingscontrole.

Voeg 2.000 geleenheden microkokkennuclease en 11 microliter 10x calciummicrokokkennucleasereactiebuffer toe aan het DNA, opgelost in de resterende 100 microliter dubbel gedestilleerd water. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.