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Isolement et normalisation de l’ADN contenant des protéines réticulées
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Biochemistry
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Isolation and Normalization of DNA Containing Crosslinked Proteins

Isolement et normalisation de l’ADN contenant des protéines réticulées

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02:49 min

April 21, 2023

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April 21, 2023

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Pour commencer l’isolement et la normalisation des protéines réticulées contenant de l’ADN, aspirer le milieu à l’aide d’une pipette aspirante après un traitement médicamenteux par ubiquitylation et SUMOylation. Rincez les cellules avec du PBS glacé avant d’ajouter 600 microlitres de réactif DNAzol. Agitez lentement la plaque sur une plate-forme vibrante pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et ajoutez 0,3 millilitre d’éthanol 100% froid directement dans la plaque.

Répétez l’agitation jusqu’à ce que l’agrégat opaque d’acides nucléiques devienne visible. Ensuite, transférez le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et centrifugez pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius à 20 000 G.Après avoir aspiré le surnageant, lavez l’acide nucléique et la pastille de protéine réticulé dans un millilitre d’éthanol à 75%, suivi de deux minutes de centrifugation à 20 000 G et quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant avant de le faire tourner à la même vitesse et d’éliminer le liquide restant à l’aide d’une pipette P-20.

Faites sécher le granulé à l’air libre pendant cinq minutes. Dissoudre la pastille d’acide nucléique séché dans 0,1 millilitre d’eau doublement distillée en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Ensuite, incubez la suspension à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 30 minutes jusqu’à ce que la pastille gonfle au moins trois fois.

Soniser les échantillons pendant 10 secondes à l’aide d’une sonde à processeur à ultrasons à 30 % d’amplitude et quantifier la concentration d’ADN à l’aide d’un spectromètre UV-Vis. Ajoutez de l’eau doublement distillée pour ajuster la concentration de l’ADN à 400 à 500 nanogrammes par microlitre dans 120 microlitres. Ensuite, transférez 20 microlitres de l’échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugation pour contrôler la charge d’ADN non digéré.

Ajouter 2 000 unités de gel de nucléase micrococcique et 11 microlitres de tampon réactionnel de nucléase micrococcique calcique 10X à l’ADN, dissous dans les 100 microlitres restants d’eau doublement distillée. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

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