בידוד ונורמליזציה של DNA המכיל חלבונים מוצלבים

כדי להתחיל את הבידוד והנורמליזציה של חלבונים צולבים המכילים DNA, לשאוף את התקשורת באמצעות פיפטה יניקה לאחר ubiquitylation וטיפול תרופתי SUMOylation. שטפו את התאים עם PBS קר כקרח לפני הוספת 600 מיקרוליטר של מגיב DNAzol. עצבו באיטיות את הצלחת על מצע רוטט במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, והוסיפו 0.3 מיליליטר אתנול קר 100% ישירות לצלחת.

חזור על התסיסה עד שמצטבר חומצת גרעין אטום הופך גלוי. לאחר מכן, להעביר את התא lysate צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר צנטריפוגה צנטריפוגה במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ב 20, 000 G.לאחר שאיפת supernatant, לשטוף את חומצת הגרעין ואת גלולת חלבון צולב במיליליטר אחד של 75% אתנול, ואחריו שתי דקות של צנטריפוגה ב 20, 000 G וארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנאטנט לפני שתסתחררו מטה באותה מהירות ותוציאו את שארית הנוזל באמצעות פיפטה P-20.

יבשו את הגלולה באוויר במשך חמש דקות. ממיסים את כדורית חומצת הגרעין המיובשת ב-0.1 מיליליטר מים מזוקקים פעמיים על ידי פיפטינג מעלה ומטה מספר פעמים. לאחר מכן, לדגור את התרחיף ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 30 דקות עד הגלולה להתנפח לפחות שלוש פעמים.

סוניק את הדגימות במשך 10 שניות באמצעות בדיקה מעבד קולי במשרעת של 30% וכמת את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרומטר UV-Vis. הוסיפו מים מזוקקים פעמיים כדי להתאים את ריכוז הדנ”א ל-400 עד 500 ננוגרם למיקרוליטר ב-120 מיקרוליטר. לאחר מכן, העבירו 20 מיקרוליטר מהדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש כבקרת טעינת DNA לא מעוכלת.

הוסף 2, 000 יחידות ג’ל של נוקלאז מיקרוקוקלי ו 11 מיקרוליטרים של 10X סידן מיקרוקוקל נוקלאז תגובה חיץ לדנ”א, מומס ב -100 מיקרוליטר הנותרים של מים מזוקקים כפולים. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.