架橋タンパク質を含むDNAの単離と標準化

DNA含有架橋タンパク質の単離および標準化を開始するには、ユビキチン化およびSUMOイル化薬物処理後に吸引ピペットを使用して培地を吸引します。600マイクロリットルのDNAzol試薬を加える前に、氷冷したPBSで細胞をすすぎます。振動プラットフォーム上でプレートを摂氏4度で10分間ゆっくりと攪拌し、0.3ミリリットルの100%冷エタノールをプレートに直接加えます。

不透明な核酸凝集体が見えるようになるまで攪拌を繰り返します。次に、細胞ライセートを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、20, 000 Gで摂氏4度で15分間遠心分離します上清を吸引した後、核酸と架橋タンパク質ペレットを1ミリリットルの75%エタノールで洗浄し、続いて20, 000 Gと4°Cで2分間遠心分離します。同じ速度でスピンダウンする前に上清を吸引し、P-20ピペットを使用して残りの液体を除去します。

ペレットを5分間風乾します。乾燥した核酸ペレットを0.1ミリリットルの二重蒸留水に数回上下にピペッティングして溶解します。次いで、ペレットが少なくとも3回膨潤するまで、懸濁液を摂氏37度の水浴中で30分間インキュベートする。

30%振幅で超音波プロセッサプローブを使用して10秒間サンプルを超音波処理し、UV-Vis分光計を使用してDNA濃度を定量化します。二重蒸留水を加えて、DNAの濃度を120マイクロリットルでマイクロリットルあたり400〜500ナノグラムに調整します。次に、未消化DNAローディングコントロールとして20マイクロリットルのサンプルを新しいマイクロ遠心チューブに移します。

2, 000ゲル単位のミクロコッカスヌクレアーゼと11マイクロリットルの10Xカルシウムミクロコッカスヌクレアーゼ反応バッファーをDNAに加え、残りの100マイクロリットルの二重蒸留水に溶解します。摂氏37度で30分間インキュベートします。