Выделение и нормализация ДНК, содержащей сшитые белки

Чтобы начать выделение и нормализацию ДНК-содержащих сшитых белков, аспирируйте среду с помощью отсасывающей пипетки после лечения убиквитилированием и препаратом SUMOylation. Промойте клетки ледяным PBS перед добавлением 600 микролитров реагента DNAzol. Медленно взбалтывайте тарелку на вибрирующей платформе в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия и добавьте 0,3 миллилитра 100% холодного этанола прямо в тарелку.

Повторяйте перемешивание до тех пор, пока не станет виден непрозрачный агрегат нуклеиновых кислот. Затем перенесите лизат клеток в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия при 20 000 G. После аспирации надосадочной жидкости промойте нуклеиновую кислоту и сшитую белковую гранулу в одном миллилитре 75% этанола, после чего последует двухминутное центрифугирование при 20 000 G и четырех градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость перед вращением с той же скоростью и удалением остатков жидкости с помощью пипетки P-20.

Высушите гранулы на воздухе в течение пяти минут. Растворите высушенную гранулу нуклеиновой кислоты в 0,1 миллилитрах дважды дистиллированной воды, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Затем выдержите суспензию при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане в течение 30 минут, пока гранула не набухнет не менее трех раз.

Ультразвук образцов в течение 10 секунд с помощью ультразвукового процессорного зонда с амплитудой 30% и количественное определение концентрации ДНК с помощью УФ-ВИД спектрометра. Добавьте воду двойной дистилляции, чтобы довести концентрацию ДНК до 400-500 нанограммов на микролитр в 120 микролитрах. Затем перенесите 20 микролитров образца в новую микроцентрифужную пробирку в качестве контроля загрузки непереваренной ДНК.

Добавьте в ДНК 2 000 гелевых единиц микрококковой нуклеазы и 11 микролитров 10-кратного реакционного буфера микрококковой нуклеазы кальция, растворенных в оставшихся 100 микролитрах воды двойной дистилляции. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.