Para comenzar el aislamiento y la normalización de las proteínas reticuladas que contienen ADN, aspire el medio con una pipeta de succión después del tratamiento farmacológico con ubiquitilación y SUMOilación. Enjuague las células con PBS helado antes de agregar 600 microlitros de reactivo DNAzol. Agite lentamente la placa sobre una plataforma vibratoria durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y agregue 0,3 mililitros de etanol 100% frío directamente a la placa.
Repita la agitación hasta que el agregado opaco de ácido nucleico se haga visible. A continuación, transfiera el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue durante 15 minutos a cuatro grados centígrados a 20.000 G. Después de aspirar el sobrenadante, lave el ácido nucleico y el gránulo de proteína reticulada en un mililitro de etanol al 75%, seguido de dos minutos de centrifugación a 20.000 g y cuatro grados centígrados. Aspirar el sobrenadante antes de centrifugar a la misma velocidad y eliminar el líquido restante con una pipeta P-20.
Seque el gránulo al aire durante cinco minutos. Disuelva el gránulo de ácido nucleico seco en 0,1 mililitros de agua bidestilada pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Luego, incube la suspensión a 37 grados centígrados en un baño de agua durante 30 minutos hasta que el gránulo se hinche al menos tres veces.
Sonicar las muestras durante 10 segundos utilizando una sonda de procesador ultrasónico al 30% de amplitud y cuantificar la concentración de ADN utilizando un espectrómetro UV-Vis. Agregue agua bidestilada para ajustar la concentración del ADN a 400 a 500 nanogramos por microlitro en 120 microlitros. Luego, transfiera 20 microlitros de la muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga como control de carga de ADN no digerido.
Agregue 2.000 unidades de gel de nucleasa microcócica y 11 microlitros de tampón de reacción de nucleasa microcócica de calcio 10X al ADN, disuelto en los 100 microlitros restantes de agua bidestilada. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos.