Çapraz Bağlı Proteinler İçeren DNA'nın İzolasyonu ve Normalizasyonu

DNA içeren çapraz bağlı proteinlerin izolasyonuna ve normalizasyonuna başlamak için, her yerde bulunma ve SUMOilasyon ilaç tedavisinden sonra bir emme pipeti kullanarak ortamı aspire edin. 600 mikrolitre DNAzol reaktifi eklemeden önce hücreleri buz gibi soğuk PBS ile durulayın. Plakayı titreşimli bir platform üzerinde dört santigrat derecede 10 dakika yavaşça çalkalayın ve doğrudan plakaya 0,3 mililitre% 100 soğuk etanol ekleyin.

Opak nükleik asit agregası görünür hale gelene kadar çalkalamayı tekrarlayın. Daha sonra, hücre lizatını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 20.000 G’de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire ettikten sonra, nükleik asidi ve çapraz bağlı protein peletini bir mililitre% 75 etanol içinde yıkayın, ardından 20.000 G ve dört santigrat derecede iki dakikalık santrifüjleme yapın. Aynı hızda dönmeden ve kalan sıvıyı bir P-20 pipeti kullanarak çıkarmadan önce süpernatanı aspire edin.

Peletleri beş dakika havayla kurutun. Kurutulmuş nükleik asit peletini 0,1 mililitre çift damıtılmış suda birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözün. Daha sonra, süspansiyonu 37 santigrat derecede bir su banyosunda 30 dakika boyunca pelet en az üç kez şişene kadar inkübe edin.

% 30 genlikte bir ultrasonik işlemci probu kullanarak numuneleri 10 saniye boyunca sonikleştirin ve bir UV-Vis spektrometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. DNA konsantrasyonunu 120 mikrolitrede mikrolitre başına 400 ila 500 nanograma ayarlamak için çift damıtılmış su ekleyin. Daha sonra, numunenin 20 mikrolitresini sindirilmemiş DNA yükleme kontrolü olarak yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Kalan 100 mikrolitre çift damıtılmış suda çözülmüş DNA’ya 2.000 jel birim mikrokokal nükleaz ve 11 mikrolitre 10X kalsiyum mikrokokal nükleaz reaksiyon tamponu ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.