567 Views
•
04:10 min
•
March 10, 2023
DOI:
Transcript
Automatically generated
للبدء ، خذ صفيحة استزراع بئر 24 جالسة مسبقا وضع زلة غطاء زجاجي في كل بئر. ثم أضف 800 ميكرولتر من وسط الاستزراع يحتوي على 10٪ FBS و DMEM. بعد ضبط تركيز الخلية.
احتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. ثم تخلص من وسط الثقافة واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. تعليق الخلايا في 800 ميكرولتر من وسط الحث DMEM الذي يحتوي على BSA.
قم بإذابة حمض اللينوليك في الإيثانول اللامائي لتحضير محلول قياسي بتركيز 100 مليمولار لكل لتر. أضف حمض اللينوليك في زيادة التدرج إلى اللوحة وكررها أربع مرات. ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
في نهاية الحضانة ، قم بإزالة وسط الثقافة وغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إصلاحها مع 400 ميكرولتر من 4 ٪ الألدهيد paraform لمدة 20 دقيقة. ثم تخلص من المحلول المثبت واغسله مرة أخرى.
احتضان الخلايا بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 60٪ لمدة خمس دقائق ثم تخلص منه. أضف الزيت الأحمر الطازج O حل العمل وتخلص منه بعد 20 إلى 30 دقيقة. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين إلى خمس مرات حتى تتم إزالة محلول الصبغة الزائد.
أعد تلطيخ النواة ب 300 ميكرولتر من محلول الهيماتوكسيلين لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ثم تخلص من محلول الصبغة واغسله مرة أخرى. قم بإزالة زلة الغطاء الزجاجي من اللوحة المغسولة PBS وضعها مع توجيه الخلايا لأسفل على شريحة مجهرية تحتوي على 10 ميكرولتر من مانع تسرب الأقراص.
لقياس حجم وعدد LDs ، قم بتشغيل مفتاح الكمبيوتر والمجهر على التوالي وضع الشريحة على منصة التحميل. ثم افتح برنامج تحليل الصور. ابحث عن الصور بطاقة منخفضة وقم بتقطير كمية مناسبة من زيت الأرز على شريحة التصوير.
اضبط الهدف 200x تدريجيا واضبط مجال الرؤية حتى يتم العثور على صورة واضحة. ثم التقط الصور من المناطق المطلوبة واحفظها. بشكل عشوائي ، حدد 60 LDs لكل صورة وقم بقياس القطر.
تصدير نتائج القياس إلى جدول لتحليل متوسط حجم LDs ونسبة التوزيع. أظهرت الخلايا المستزرعة في خلايا الكبد الملطخة أحجاما وأعدادا مختلفة من LDs. تحت تركيزات مختلفة من العلاج حمض اللينوليك.
كان عدد LDs لكل خلية مرتبطا سلبا بتركيزات مختلفة من حمض اللينوليك. كان متوسط عدد LD لكل خلية 136 لمجموعة 100 ميكرومولار لكل لتر من حمض اللينوليك وانخفض عند تركيزات عالية. كان متوسط قطر LDs في المجموعة الضابطة 0.72 ميكرومتر والذي زاد مع زيادة التركيز في المجموعة المعالجة بحمض اللينوليك.
أدى التركيز العالي لحمض اللينوليك إلى زيادة نسبة LDs الكبيرة وتقليل LDs الصغيرة.
Read Article
Cite this Article
Yang, J., Kang, F., Wei, A., Lu, W., Zhang, X., Han, L. Oil Red O Staining and Measurement of Lipid Droplets (LDs) in Bovine Hepatocyte Cells. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e200276, doi:10.3791/200276 (2023).
Copy