Olie rode O-kleuring en meting van lipidedruppels (LDs) in runderhepatocytencellen

Neem om te beginnen een eerder zittende 24-putcultuurplaat en plaats een glazen afdekplaat in elke put. Voeg vervolgens 800 microliter kweekmedium toe dat 10% FBS en DMEM bevat. Na aanpassing van de celconcentratie.

Incubeer het bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Gooi vervolgens het kweekmedium weg en was de cellen met PBS. Suspensie van de cellen in 800 microliter DMEM-inductiemedium dat BSA bevat.

Los linolzuur op in watervrije ethanol om een standaardoplossing te bereiden in een concentratie van 100 millimolar per liter. Voeg linolzuur in toenemende gradiënt toe aan de plaat en herhaal dit vier keer. Incubeer de plaat vervolgens op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.

Verwijder aan het einde van de incubatie het kweekmedium en was de cellen drie keer met PBS. Bevestig ze met 400 microliter 4% paraform aldehyde gedurende 20 minuten. Gooi vervolgens de fixatieve oplossing weg en was ze opnieuw.

Incubeer de cellen met 60% isopropylalcohol gedurende vijf minuten en gooi het vervolgens weg. Voeg vers bereide olie rode O werkoplossing toe en gooi deze na 20 tot 30 minuten weg. Was de cellen twee tot vijf keer met PBS totdat de overtollige kleurstofoplossing is verwijderd.

Bevlek de kern opnieuw met 300 microliter hematoxyline-oplossing gedurende één tot twee minuten. Gooi vervolgens de kleurstofoplossing weg en was ze opnieuw. Verwijder de glazen afdekslip van de PBS-gewassen plaat en plaats deze met cellen naar beneden gericht op een microscopisch klein glaasje met 10 microliter tabletkit.

Om de grootte en het aantal LD’s te meten, schakelt u achtereenvolgens de computer- en microscoopschakelaar in en plaatst u de dia op het laadplatform. Open vervolgens de beeldanalysesoftware. Zoek de afbeeldingen op laag vermogen en druppel een geschikte hoeveelheid cederolie op de beelddia.

Pas het objectief geleidelijk 200x aan en pas het gezichtsveld aan totdat er een duidelijk beeld is gevonden. Leg vervolgens afbeeldingen vast uit de gewenste regio’s en sla ze op. Selecteer willekeurig 60 LD’s voor elke afbeelding en meet de diameter.

Exporteer de meetresultaten naar een tabel om de gemiddelde grootte en distributieverhouding van LDs te analyseren. De gekleurde hepatocytengekweekte cellen vertoonden verschillende groottes en aantallen LD’s. Onder de verschillende concentraties van linolzuurbehandeling.

Het aantal LDs per cel was negatief gecorreleerd met verschillende concentraties linolzuur. Het mediane LD-getal per cel was 136 voor de met 100 micromolair per liter linolzuur behandelde groep en daalde bij hoge concentraties. De gemiddelde diameter van LDs in de controlegroep was 0,72 micrometer, die toenam met toenemende concentratie in de met linolzuur behandelde groep.

Een hoge linolzuurconcentratie verhoogde het aandeel van grote LDs en verminderde kleine LDs.