שמן אדום O צביעה ומדידה של טיפות שומנים (LDs) בתאי הפטוציטים של בקר

כדי להתחיל, קחו צלחת תרבית 24 בארות שישבה בעבר והניחו בכל באר כיסוי זכוכית. לאחר מכן להוסיף 800 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל 10% FBS ו- DMEM. לאחר התאמת ריכוז התא.

לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. לאחר מכן השליכו את מדיום התרבית ושטפו את התאים עם PBS. להשעות את התאים ב 800 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה DMEM המכיל BSA.

להמיס חומצה לינולאית באתנול נטול מים להכנת תמיסה סטנדרטית בריכוז של 100 מילימולר לליטר. מוסיפים חומצה לינולאית בשיפוע הולך וגובר לצלחת וחוזרים עליה ארבע פעמים. לאחר מכן לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות.

בסוף הדגירה, להסיר את המדיום תרבית ולשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. תקן אותם עם 400 מיקרוליטר של אלדהיד 4% paraform במשך 20 דקות. לאחר מכן השליכו את הפתרון המקבע ושטפו אותם שוב.

לדגור על התאים עם 60% אלכוהול איזופרופיל במשך חמש דקות ולאחר מכן להשליך אותו. מוסיפים שמן טרי אדום O פתרון עבודה ולהשליך אותו לאחר 20 עד 30 דקות. שטפו את התאים עם PBS פעמיים עד חמש פעמים עד להסרת תמיסת הצבע העודפת.

לצבוע את הגרעין עם 300 מיקרוליטר של פתרון hematoxylin במשך דקה עד שתי דקות. לאחר מכן השליכו את תמיסת הצבע ושטפו אותם שוב. הסר את החלקת מכסה הזכוכית מצלחת הכביסה PBS והנח אותה עם תאים הפונים כלפי מטה על שקופית מיקרוסקופית המכילה 10 מיקרוליטר של חומר איטום טבליות.

כדי למדוד את הגודל והמספר של LDs, הפעל את המחשב ואת מתג המיקרוסקופ ברציפות והנח את השקופית על פלטפורמת הטעינה. לאחר מכן פתח את תוכנת ניתוח התמונות. מצא את התמונות בעוצמה נמוכה וטפטף כמות מתאימה של שמן ארז על שקופית ההדמיה.

כוונן בהדרגה את המטרה פי 200 והתאם את שדה הראייה עד שתימצא תמונה ברורה. לאחר מכן צלם תמונות מהאזורים הרצויים ושמור אותן. באופן אקראי, בחר 60 LDs לכל תמונה ומדוד את הקוטר.

יצא את תוצאות המדידה לטבלה כדי לנתח את הגודל הממוצע ויחס ההתפלגות של LD. תאי תרבית הפטוציטים המוכתמים הראו גדלים ומספרים שונים של LDs. תחת ריכוזים שונים של טיפול חומצה לינולאית.

מספר LDs לכל תא היה בקורלציה שלילית עם ריכוזים שונים של חומצה לינולאית. מספר ה-LD החציוני לתא היה 136 בקבוצה שטופלה בחומצה לינולאית של 100 מיקרומולר לליטר וירד בריכוזים גבוהים. הקוטר הממוצע של LDs בקבוצת הביקורת היה 0.72 מיקרומטר, אשר גדל עם העלייה בריכוז בקבוצה שטופלה בחומצה לינולאית.

ריכוז גבוה של חומצה לינולאית הגדיל את חלקם של LDs גדולים והפחית LDs קטנים.