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Colorazione rosso olio O e misurazione delle goccioline lipidiche (LD) nelle cellule di epatociti bovini
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Oil Red O Staining and Measurement of Lipid Droplets (LDs) in Bovine Hepatocyte Cells

Colorazione rosso olio O e misurazione delle goccioline lipidiche (LD) nelle cellule di epatociti bovini

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04:10 min

March 10, 2023

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04:10 min
March 10, 2023

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Per iniziare, prendi una piastra di coltura a 24 pozzetti precedentemente posizionata e posiziona un vetrino di copertura in ogni pozzetto. Quindi aggiungere 800 microlitri di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e DMEM. Dopo aver regolato la concentrazione cellulare.

Incubarlo a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Quindi scartare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS. Sospendere le cellule in 800 microlitri di mezzo di induzione DMEM contenente BSA.

Sciogliere l’acido linoleico in etanolo anidro per preparare una soluzione standard ad una concentrazione di 100 millimolari per litro. Aggiungere acido linoleico in gradiente crescente alla piastra e ripeterlo quattro volte. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Alla fine dell’incubazione, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS tre volte. Fissarli con 400 microlitri di aldeide paraforme al 4% per 20 minuti. Quindi scartare la soluzione fissativa e lavarli di nuovo.

Incubare le cellule con alcool isopropilico al 60% per cinque minuti, quindi scartarlo. Aggiungere la soluzione di lavoro rosso O appena preparata e gettarla dopo 20-30 minuti. Lavare le cellule con PBS da due a cinque volte fino a rimuovere la soluzione di colorante in eccesso.

Conservare il nucleo con 300 microlitri di soluzione di ematossilina per uno o due minuti. Quindi scartare la soluzione colorante e lavarli di nuovo. Rimuovere il vetrino di vetro dalla piastra lavata PBS e posizionarlo con le celle rivolte verso il basso su un vetrino microscopico contenente 10 microlitri di sigillante per compresse.

Per misurare le dimensioni e il numero di LD, accendere successivamente l’interruttore del computer e del microscopio e posizionare il vetrino sulla piattaforma di carico. Quindi aprire il software di analisi delle immagini. Trova le immagini a bassa potenza e gocciola una quantità appropriata di olio di cedro sul vetrino di imaging.

Regolare gradualmente l’obiettivo 200x e regolare il campo visivo fino a trovare un’immagine chiara. Quindi cattura le immagini dalle regioni desiderate e salvale. In modo casuale, seleziona 60 LD per ogni immagine e misura il diametro.

Esportare i risultati delle misurazioni in una tabella per analizzare le dimensioni medie dei LD e il rapporto di distribuzione. Le cellule in coltura di epatociti colorati hanno mostrato diverse dimensioni e numero di LD. Sotto le diverse concentrazioni di trattamento con acido linoleico.

Il numero di LD per cellula era negativamente correlato con diverse concentrazioni di acido linoleico. Il numero mediano di LD per cellula era 136 per il gruppo trattato con acido linoleico 100 micromolari per litro e diminuiva ad alte concentrazioni. Il diametro medio delle LD nel gruppo di controllo era di 0,72 micrometri che aumentava con l’aumentare della concentrazione nel gruppo trattato con acido linoleico.

Un’alta concentrazione di acido linoleico ha aumentato la proporzione di LD grandi e diminuito i piccoli LD.

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