Para começar, pegue uma placa de cultura de 24 poços previamente assentada e coloque uma tampa de vidro em cada poço. Em seguida, adicionar 800 microlitros de meio de cultura contendo 10% de FBS e DMEM. Após o ajuste da concentração celular.
Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Em seguida, descarte o meio de cultura e lave as células com PBS. Suspender as células em 800 microlitros de meio de indução DMEM contendo BSA.
Dissolver o ácido linoleico em etanol anidro para preparar uma solução-padrão a uma concentração de 100 milimolares por litro. Adicione o ácido linoleico em gradiente crescente à placa e repita quatro vezes. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
Ao final da incubação, retirar o meio de cultura e lavar as células com PBS três vezes. Fixe-os com 400 microlitros de aldeído paraforme a 4% por 20 minutos. Em seguida, descarte a solução fixadora e lave-a novamente.
Incubar as células com álcool isopropílico a 60% por cinco minutos e descartá-las. Adicione o óleo recém-preparado vermelho O solução de trabalho e elimine-o após 20 a 30 minutos. Lave as células com PBS duas a cinco vezes até que o excesso de solução corante seja removido.
Restain o núcleo com 300 microlitros de solução de hematoxilina por um a dois minutos. Em seguida, descarte a solução de corante e lave-os novamente. Remova a tampa de vidro da placa lavada PBS e coloque-a com as células viradas para baixo em uma lâmina microscópica contendo 10 microlitros de selante de comprimido.
Para medir o tamanho e o número de LDs, ligue o interruptor do computador e do microscópio sucessivamente e coloque a lâmina na plataforma de carregamento. Em seguida, abra o software de análise de imagem. Encontre as imagens em baixa potência e pinge uma quantidade apropriada de óleo de cedro na lâmina de imagem.
Ajuste gradualmente o objetivo 200x e ajuste o campo de visão até que uma imagem clara seja encontrada. Em seguida, capture imagens das regiões desejadas e salve-as. Aleatoriamente, selecione 60 LDs para cada imagem e meça o diâmetro.
Exporte os resultados da medição para uma tabela para analisar o tamanho médio e a razão de distribuição dos LDs. As células coradas com hepatócitos cultivadas apresentaram diferentes tamanhos e números de DLs. Sob as diferentes concentrações de tratamento com ácido linoleico.
O número de DLs por célula correlacionou-se negativamente com diferentes concentrações de ácido linoleico. A mediana do número de DL por célula foi de 136 para o grupo tratado com ácido linoleico de 100 micromolares por litro e diminuiu em altas concentrações. O diâmetro médio das DLs no grupo controle foi de 0,72 micrômetros, que aumentou com o aumento da concentração no grupo tratado com ácido linoleico.
Uma alta concentração de ácido linoleico aumentou a proporção de grandes DLs e diminuiu as pequenas DLs.