Yağ Kırmızısı O Sığır Hepatosit Hücrelerinde Lipit Damlacıklarının (LD) Boyanması ve Ölçümü

Başlamak için, daha önce oturmuş 24 kuyulu bir kültür plakası alın ve her bir kuyucuğa bir cam kapak kayması yerleştirin. Ardından,% 10 FBS ve DMEM içeren 800 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Hücre konsantrasyonunu ayarladıktan sonra.

24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra kültür ortamını atın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreleri BSA içeren 800 mikrolitre DMEM indüksiyon ortamında askıya alın.

Litre başına 100 milimolar konsantrasyonda standart bir çözelti hazırlamak için linoleik asidi susuz etanol içinde çözün. Plakaya artan gradyanda linoleik asit ekleyin ve dört kez tekrarlayın. Daha sonra plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Bunları 20 dakika boyunca 400 mikrolitre% 4 paraform aldehit ile sabitleyin. Sonra fiksatif çözeltiyi atın ve tekrar yıkayın.

Hücreleri% 60 izopropil alkol ile beş dakika boyunca inkübe edin ve ardından atın. Taze hazırlanmış yağ kırmızısı O çalışma çözeltisini ekleyin ve 20 ila 30 dakika sonra atın. Fazla boya çözeltisi çıkarılana kadar hücreleri PBS ile iki ila beş kez yıkayın.

Çekirdeği 300 mikrolitre hematoksilin çözeltisi ile bir ila iki dakika bekletin. Sonra boya çözeltisini atın ve tekrar yıkayın. Cam kapak kayışını PBS yıkanmış plakadan çıkarın ve 10 mikrolitre tablet sızdırmazlık maddesi içeren mikroskobik bir slayt üzerine aşağı bakan hücrelerle yerleştirin.

LD’lerin boyutunu ve sayısını ölçmek için, bilgisayarı ve mikroskop anahtarını art arda açın ve slaytı yükleme platformuna yerleştirin. Ardından görüntü analiz yazılımını açın. Görüntüleri düşük güçte bulun ve görüntüleme slaytına uygun miktarda sedir yağı damlatın.

200x hedefini kademeli olarak ayarlayın ve net bir görüntü bulunana kadar görüş alanını ayarlayın. Ardından istediğiniz bölgelerden görüntüler yakalayın ve kaydedin. Rastgele olarak, her görüntü için 60 LD seçin ve çapı ölçün.

LD’lerin ortalama boyutunu ve dağılım oranını analiz etmek için ölçüm sonuçlarını bir tabloya aktarın. Boyanmış hepatosit kültürlü hücreler farklı boyutlarda ve sayıda LD gösterdi. Linoleik asit tedavisinin farklı konsantrasyonları altında.

Hücre başına LD sayısı, farklı linoleik asit konsantrasyonları ile negatif korelasyon gösterdi. Hücre başına medyan LD sayısı, litre linoleik asit ile muamele edilen grup başına 100 mikromolar için 136 idi ve yüksek konsantrasyonlarda azaldı. Kontrol grubundaki LD’lerin ortalama çapı 0.72 mikrometre idi ve linoleik asitle tedavi edilen grupta artan konsantrasyonla artmıştır.

Yüksek linoleik asit konsantrasyonu, büyük LD’lerin oranını arttırdı ve küçük LD’leri azalttı.