Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
-ابدأ بوضع الديدان ذاتية الإخصاب في مرحلتها الأخيرة من اليرقات على لوحات بذرت بمصدر غذائي بكتيري. السماح لليرقات أن تتطور إلى البالغين ناضجة حتى يكون هناك وفرة من البيض داخل الديدان ووضعها على لوحات. غسل لوحات مع العازلة لجمع البيض والديدان.
بعد ذلك ، استبدل المخزن المؤقت بمحلول التبييض الذي يذوب الديدان البالغة. محمية من قشر البيض، والأجنة البقاء على قيد الحياة هذا العلاج، على الرغم من أنها سوف تكون في مراحل مختلفة من التنمية. ثم استبدال التبييض مع العازلة والسماح للأجنة لتطوير. كما تفقس اليرقات من قشر البيض في غياب الطعام ، فإن التنمية ستتوقف عند مرحلة اليرقات الأولى.
نقل اليرقات إلى لوحات مع الغذاء لاستئناف التنمية. وهذا سوف يحفز التقدم المتزامن من خلال مراحل اليرقات المتبقية.
عندما تصل الديدان إلى المرحلة الأخيرة من اليرقات ، قم بنقلها إلى لوحات مع الطعام وFUdR ، وهو مثبط تخليق الحمض النووي الذي يمنع إنتاج النسل. التنمية المستمرة في وجود FUdR تنتج مجموعة من الديدان البالغة العقيمة. في هذه التجربة ، سنقوم بمزامنة مجموعة من النيماتودا C. elegans.
-للبدء، نقل يرقات L4 من الخلفيات الوراثية المطلوبة على العشب الطازج من الإشريكية القولونية على وسائل الإعلام نمو النيماتودا أو لوحات NGM. استخدام ما لا يقل عن اثنين من 100 ملليمتر أو ثلاث لوحات 60 ملليمتر لكل سلالة.
احتضان الديدان في درجة حرارة النمو المناسبة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام أو حتى تتركز لوحات مع عدد كبير من البيض والديدان gravid. غسل البيض والديدان قبالة لوحات باستخدام ما يقرب من ستة ملليلتر من العازلة M9 لكل لوحة 100 ملليمتر من الديدان الخيطية. باستخدام ماصة باستور الزجاج، نقل البيض والديدان في أنابيب الطرد المركزي 15 ملليلتر الفردية لكل سلالة. تدور هذه الأنابيب إلى أسفل لمدة ثلاث دقائق في 6,180 غرام.
بعد الطرد المركزي، يستنشق المخزن المؤقت M9 مع الاحتفاظ فقط بيليه الحيوان والبيض. أضف ثلاثة إلى أربعة ملليلترات من محلول التبييض لكل أنبوب ودوامة متقطعة لمدة ست دقائق.
ثم أضف المخزن المؤقت M9 لملء كل أنبوب وتدور في 6180 غرام لمدة دقيقة واحدة. يستنشق supernatant وتكرار هذا الغسيل مع M9 ثلاث مرات.
بعد الغسيل، قم بتحريك بيليه البيض إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر يحتوي على ما يقرب من تسعة ملليلترات من المخزن المؤقت M9. مزامنة الديدان الطازجة عن طريق nutating في 20 درجة مئوية لمدة 16 إلى 48 ساعة.
بعد الغزل هذه الأنابيب إلى أسفل في 6,180 غرام لمدة 1.5 دقيقة, وضع الحيوانات L1 متزامنة أسفل على حديقة البذور الطازجة من OP50 على لوحات NGM الفردية. حافظ على اللوحات عند 20 درجة مئوية حتى تصل الحيوانات إلى مرحلة يرقات L4 بعد حوالي 42 ساعة. في هذا الوقت ، استخدم اختيار البلاتين لنقل يرقات L4 إلى لوحات NGM المصنفة OP50 التي تحتوي على 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من FUdR لمنعها من إنتاج ذرية.
