Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
-Begynd med at placere selvbefrugtende orme i deres sidste larvestadie på plader seedet med en bakteriel fødekilde. Lad larverne udvikle sig til modne voksne, indtil der er en overflod af æg i orme og lagt på pladerne. Vask pladerne med buffer for at samle æg og orme.
Dernæst erstatte bufferen med blegemiddelopløsning, der opløser voksne orme. Beskyttet af æggeskallen vil embryoner overleve denne behandling, selvom de vil være på forskellige udviklingsstadier. Udskift derefter blegemidlet med buffer og lad embryonerne udvikle sig. Når larver lukker fra deres æggeskaller i mangel af mad, vil udviklingen stoppe ved første larvestadium.
Overfør larverne til plader med mad for at genoptage udviklingen. Dette vil stimulere synkron progression gennem de resterende larvestadier.
Når orme når det sidste larvestadium, skal du flytte dem til plader med mad og FUdR, en DNA-syntesehæmmer, der forhindrer produktion af afkom. Fortsat udvikling i nærværelse af FUdR producerer en population af sterile voksne orme. I dette eksperiment vil vi synkronisere en befolkning af nematode C. elegans.
-Til at begynde med overføre L4 larver af ønskede genetiske baggrunde på en frisk seedet græsplæne af Escherichia coli på nematode vækstmedier eller NGM plader. Brug mindst to 100 millimeter eller tre 60 millimeter plader for hver stamme.
Inkuber ormene ved den passende væksttemperatur i tre til fire dage, eller indtil pladerne er koncentreret med et stort antal æg og gravid orme. Vask æg og orme af pladerne ved hjælp af ca. seks milliliter M9 buffer pr. 100 millimeter plade nematoder. Brug glas Pasteur pipetter, overføre æg og orme i individuelle 15 milliliter centrifuge rør for hver stamme. Spin disse rør ned i tre minutter på 6.180 g.
Efter centrifugering suges M9-bufferen ud og bevarer kun dyret og ægpillen. Tilsæt tre til fire milliliter blegemiddelopløsning til hvert rør og intermitterende vortex i seks minutter.
Derefter tilsættes M9 buffer til at fylde hvert rør og spin på 6.180 g i et minut. Aspirere supernatant og gentag denne vask med M9 tre gange.
Efter vask, flytte ægget pellet til en frisk 15 milliliter rør, der indeholder cirka ni milliliter M9 buffer. Synkroniser de nyklækkede orme ved at møtrikere ved 20 grader Celsius i 16 til 48 timer.
Efter at have drejet disse rør ned på 6.180 g i 1,5 minutter, skal du sætte de synkroniserede L1-dyr ned på en nysået græsplæne på OP50 på individuelle NGM-plader. Hold pladerne ved 20 grader Celsius, indtil dyrene når L4 larvestadiet efter ca. 42 timer. På dette tidspunkt skal du bruge et platinplukke til at flytte L4-larverne til OP50-seedede NGM-plader, der indeholder 0,5 milligram pr. milliliter FUdR for at forhindre dem i at producere afkom.