Nematodensynchronisatie: een methode om populaties wormen in identieke stadia van ontwikkeling te verkrijgen

-Begin met het plaatsen van zelfbevruchtende wormen in hun laatste larvale stadium op platen gezaaid met een bacteriële voedselbron. Laat de larven zich ontwikkelen tot volwassen volwassenen totdat er een overvloed aan eieren in wormen zit en op de platen wordt gelegd. Was de borden met buffer om de eieren en wormen te verzamelen.

Vervang vervolgens de buffer door bleekmiddeloplossing die volwassen wormen oplost. Beschermd door de eierschaal zullen embryo's deze behandeling overleven, hoewel ze zich in verschillende stadia van ontwikkeling bevinden. Vervang vervolgens het bleekmiddel door buffer en laat de embryo's zich ontwikkelen. Als larven uit hun eierschalen komen bij afwezigheid van voedsel, zal de ontwikkeling in het eerste larvale stadium pauzeren.

Breng de larven over op borden met voedsel om de ontwikkeling te hervatten. Dit stimuleert de synchrone progressie door de resterende larvale stadia.

Wanneer wormen het laatste larvale stadium bereiken, verplaats ze dan naar borden met voedsel en FUdR, een DNA-syntheseremmer die de productie van nakomelingen voorkomt. Voortdurende ontwikkeling in aanwezigheid van FUdR produceert een populatie steriele volwassen wormen. In dit experiment zullen we een populatie van de nematoden C. elegans synchroniseren.

-Breng om te beginnen L4-larven met de gewenste genetische achtergrond over op een vers gezaaid gazon van Escherichia coli op nematodengroeimedia of NGM-platen. Gebruik ten minste twee platen van 100 millimeter of drie platen van 60 millimeter voor elke soort.

Incubeer de wormen bij de juiste groeitemperatuur gedurende drie tot vier dagen of totdat de platen zijn geconcentreerd met een groot aantal eieren en gravidwormen. Was de eieren en wormen van de platen met ongeveer zes milliliter M9-buffer per 100 millimeter plaat nematoden. Breng met behulp van glazen Pasteur pipetten de eieren en wormen over in individuele centrifugebuizen van 15 milliliter voor elke soort. Draai deze buizen drie minuten naar beneden op 6.180 g.

Na centrifugeren, aspireren uit de M9 buffer met behoud van alleen het dier en ei pellet. Voeg drie tot vier milliliter bleekoplossing toe aan elke buis en draai met tussenpozen gedurende zes minuten.

Voeg vervolgens de M9-buffer toe om elke buis te vullen en draai gedurende één minuut op 6.180 g. Aspireer de supernatant en herhaal deze wasbeurt drie keer met M9.

Verplaats de eierkorrel na het wassen naar een verse buis van 15 milliliter met ongeveer negen milliliter M9-buffer. Synchroniseer de vers uitgekomen wormen door 16 tot 48 uur op 20 graden Celsius te noteren.

Nadat u deze buizen gedurende 1,5 minuten op 6.180 g hebt gedraaid, legt u de gesynchroniseerde L1-dieren neer op een vers gezaaid gazon van OP50 op individuele NGM-platen. Houd de platen op 20 graden Celsius totdat de dieren na ongeveer 42 uur het L4-larvale stadium bereiken. Gebruik op dit moment een platinapriem om de L4-larven te verplaatsen naar OP50 gezaaide NGM-platen met 0,5 milligram per milliliter FUdR om te voorkomen dat ze nakomelingen produceren.