Synchronisation des nématodes : une méthode pour obtenir des populations de vers à des stades identiques de développement

-Commencez par placer des vers auto-fertilisants à leur dernier stade larvaire dans des assiettes ensemencées avec une source de nourriture bactérienne. Laissez les larves se développer en adultes matures jusqu’à ce qu’il y ait une abondance d’œufs dans les vers et pondus sur les plaques. Laver les assiettes avec un tampon pour recueillir les œufs et les vers.

Ensuite, remplacez le tampon par une solution d’eau de Javel qui dissout les vers adultes. Protégés par la coquille d’œuf, les embryons survivront à ce traitement, bien qu’ils en soient à différents stades de développement. Ensuite, remplacez l’eau de Javel par un tampon et laissez les embryons se développer. À mesure que les larves éclosent de leurs coquilles d’œufs en l’absence de nourriture, le développement s’arrêtera au premier stade larvaire.

Transférer les larves dans des assiettes avec de la nourriture pour reprendre le développement. Ceci stimulera la progression synchrone par les étapes larvaire restantes.

Lorsque les vers atteignent le dernier stade larvaire, déplacez-les dans des assiettes avec de la nourriture et du FUdR, un inhibiteur de synthèse de l’ADN qui empêche la production de descendants. Le développement continu en présence de FUdR produit une population de vers adultes stériles. Dans cette expérience, nous synchroniserons une population du nématode C. elegans.

-Pour commencer, transférez des larves L4 de milieux génétiques désirés sur une pelouse fraîchement ensemencée d’Escherichia coli sur des supports de croissance nématode ou des plaques NGM. Utilisez au moins deux plaques de 100 millimètres ou trois plaques de 60 millimètres pour chaque souche.

Incuber les vers à la température de croissance appropriée pendant trois à quatre jours ou jusqu’à ce que les plaques soient concentrées avec un grand nombre d’œufs et de vers gravids. Lavez les œufs et les vers des plaques à l’aide d’environ six millilitres de tampon M9 par plaque de nématodes de 100 millimètres. À l’aide de pipettes Pasteur en verre, transférer les œufs et les vers dans des tubes de centrifugeuse individuels de 15 millilitres pour chaque souche. Faites tourner ces tubes pendant trois minutes à 6 180 g.

Après centrifugation, aspirez le tampon M9 en conservant seulement l’animal et la pastille d’oeuf. Ajouter trois à quatre millilitres de solution d’eau de Javel à chaque tube et vortex par intermittence pendant six minutes.

Ajouter ensuite le tampon M9 pour remplir chaque tube et tourner à 6 180 g pendant une minute. Aspirer le supernatant et répéter ce lavage avec M9 trois fois.

Après le lavage, déplacez la pastille d’œuf dans un tube frais de 15 millilitres contenant environ neuf millilitres de tampon M9. Synchronisez les vers fraîchement éclos en les nutant à 20 degrés Celsius pendant 16 à 48 heures.

Après avoir fait tourner ces tubes à 6 180 g pendant 1,5 minute, ez les animaux synchronisés L1 sur une pelouse fraîchement ensemencée d’OP50 sur des plaques NGM individuelles. Gardez les plaques à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les animaux atteignent le stade larvaire L4 après environ 42 heures. À l’heure actuelle, utilisez un pic de platine pour déplacer les larves L4 vers des plaques de MNM ensemencées OP50 contenant 0,5 milligramme par millilitre de DIU pour les empêcher de produire de la descendance.