Nematode-Synchronisation: Eine Methode, um Populationen von Würmern in identischen Entwicklungsstadien zu erhalten

-Beginnen Sie, indem Sie selbstbefruchtende Würmer in ihrer letzten Larvenstufe auf Tellern platzieren, die mit einer bakteriellen Nahrungsquelle gesät sind. Lassen Sie die Larven zu reifen Erwachsenen entwickeln, bis es eine Fülle von Eiern in Würmern gibt und auf die Teller gelegt wird. Waschen Sie die Teller mit Puffer, um die Eier und Würmer zu sammeln.

Als nächstes ersetzen Sie den Puffer durch Bleichlösung, die erwachsene Würmer auflöst. Geschützt durch die Eierschale werden Embryonen diese Behandlung überleben, obwohl sie sich in verschiedenen Entwicklungsstadien befinden werden. Dann ersetzen Sie die Bleiche durch Puffer und lassen Sie die Embryonen entwickeln. Wenn Larven in Abwesenheit von Nahrung aus ihren Eierschalen schlüpfen, wird die Entwicklung im ersten Larvenstadium zum Erdenkchen.

Übertragen Sie die Larven auf Teller mit Nahrung, um die Entwicklung wieder aufzunehmen. Dies stimuliert die synchrone Progression durch die verbleibenden Larvenstadien.

Wenn Würmer das letzte Larvenstadium erreichen, bewegen Sie sie auf Teller mit Nahrung und FUdR, einem DNA-Synthese-Inhibitor, der die Produktion von Nachkommen verhindert. Die kontinuierliche Entwicklung in Gegenwart von FUdR produziert eine Population von sterilen erwachsenen Würmern. In diesem Experiment werden wir eine Population der Nematode C. eleganssynchronisieren.

-Um zu beginnen, übertragen L4 Larven der gewünschten genetischen Hintergründe auf einen frisch gesäten Rasen von Escherichia coli auf Nematoden-Wachstumsmedien oder NGM-Platten. Verwenden Sie mindestens zwei 100-Millimeter- oder drei 60-Millimeter-Platten für jede Dehnung.

Die Würmer drei bis vier Tage lang bei entsprechender Wachstumstemperatur bebrüten oder bis die Platten mit einer großen Anzahl von Eiern und Gravidwürmern konzentriert sind. Waschen Sie die Eier und Würmer von den Tellern mit etwa sechs MilliliterM9-Puffer pro 100-Millimeter-Platte Nematoden. Mit Glas Pasteur Pipetten, übertragen Sie die Eier und Würmer in einzelne 15 Milliliter Zentrifugenrohre für jede Sorte. Drehen Sie diese Rohre für drei Minuten bei 6.180 g nach unten.

Nach der Zentrifugation, aspirieren Sie den M9-Puffer, der nur das Tier und Eipellet behält. Fügen Sie drei bis vier Milliliter Bleichlösung zu jedem Rohr und intermittierend Wirbel für sechs Minuten.

Fügen Sie dann M9-Puffer hinzu, um jedes Rohr zu füllen und drehen Sie bei 6.180 g für eine Minute. Den Überstand ansaugen und diese Wäsche mit M9 dreimal wiederholen.

Nach dem Waschen das Eipellet in ein frisches 15-Milliliter-Rohr mit etwa neun MilliliterM9-Puffer bewegen. Synchronisieren Sie die frisch geschlüpften Würmer, indem Sie 16 bis 48 Stunden bei 20 Grad Celsius nisieren.

Nachdem Sie diese Rohre 1,5 Minuten lang bei 6.180 g nach unten gesponnen haben, legen Sie die synchronisierten L1-Tiere auf einen frisch gesäten Rasen von OP50 auf einzelne NGM-Platten. Halten Sie die Platten bei 20 Grad Celsius, bis die Tiere nach ca. 42 Stunden das L4-Larvenstadium erreichen. Zu diesem Zeitpunkt verwenden Sie einen Platin-Pick, um die L4-Larven auf OP50-gesäte NGM-Platten mit 0,5 Milligramm pro Milliliter FUdR zu bewegen, um zu verhindern, dass sie Nachkommen produzieren.