Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
-התחילו בהנחת תולעים מפרות את עצמן בשלב הזחל האחרון שלהן על צלחות שנזרעו במקור מזון חיידקי. אפשר לזחלים להתפתח למבוגרים בוגרים עד שיהיה שפע של ביצים בתוך תולעים ויוטלו על הצלחות. לשטוף את הצלחות עם חיץ כדי לאסוף את הביצים והתולעים.
לאחר מכן, החלף את המאגר בתמיסת אקונומיקה הממיסה תולעים בוגרות. מוגן על ידי קליפת הביצה, עוברים ישרדו את הטיפול הזה, אם כי הם יהיו בשלבים שונים של התפתחות. ואז להחליף את אקונומיקה עם חיץ ולאפשר לעוברים להתפתח. כאשר הזחלים בוקעים ממדפי הביצים שלהם בהיעדר מזון, ההתפתחות תעצור בשלב הזחל הראשון.
מעבירים את הזחלים לצלחות עם אוכל כדי לחדש את הפיתוח. זה יעורר התקדמות סינכרונית דרך שלבי הזחל הנותרים.
כאשר תולעים מגיעות לשלב הזחל האחרון, מעבירות אותן לצלחות עם מזון ו- FUdR, מעכב סינתזת DNA המונע ייצור צאצאים. המשך ההתפתחות בנוכחות FUdR מייצר אוכלוסייה של תולעים בוגרות סטריליות. בניסוי זה נסנכרן אוכלוסייה של נמטודה C. אלגנס.
-כדי להתחיל, להעביר זחלים L4 של הרקע הגנטי הרצוי על מדשאה זרע טרי של Escherichia coli על מדיה צמיחה נמטודה או צלחות NGM. השתמש לפחות שני 100 מילימטר או שלושה צלחות 60 מילימטר עבור כל זן.
דגירה את התולעים בטמפרטורת הצמיחה המתאימה במשך שלושה עד ארבעה ימים או עד צלחות מרוכזים עם מספר גדול של ביצים תולעים gravid. לשטוף את הביצים והתולעים את הצלחות באמצעות כ 6 מיליליטר של חיץ M9 לכל צלחת 100 מילימטר של nematodes. באמצעות זכוכית פיפטות פסטר, להעביר את הביצים והתולעים לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים 15 מיליליטר עבור כל זן. לסובב את הצינורות האלה למטה במשך שלוש דקות ב 6,180 גרם.
לאחר צנטריפוגה, לשאוף את חיץ M9 שמירה רק את החיה ואת גלולת הביצה. מוסיפים שלושה עד ארבעה מיליליטר של פתרון אקונומיקה לכל צינור ומערבולת לסירוגין במשך שש דקות.
לאחר מכן להוסיף מאגר M9 כדי למלא כל צינור ולסובב ב 6,180 גרם לדקה אחת. לשאוף את supernatant ולחזור על שטיפה זו עם M9 שלוש פעמים.
לאחר הכביסה, להעביר את גלולת הביצה לצינור טרי 15 מיליליטר המכיל כתשעה מיליליטר של חיץ M9. סנכרנו את התולעים הטריות על ידי אגוזים ב-20 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 48 שעות.
לאחר סיבוב צינורות אלה למטה ב 6,180 גרם במשך 1.5 דקות, לשים את בעלי החיים L1 מסונכרן למטה על מדשאה זרע טרי של OP50 על לוחות NGM בודדים. שמור את הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס עד בעלי החיים להגיע לשלב הזחל L4 לאחר כ 42 שעות. בשלב זה, השתמש בבחירת פלטינה כדי להעביר את זחלי L4 ללוחות NGM זרעי OP50 המכילים 0.5 מיליגרם למיליליטר של FUdR כדי למנוע מהם לייצר צאצאים.
