Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
-Begynn med å plassere selvbefruktende ormer i deres siste larvetrinn på tallerkener frøet med en bakteriell matkilde. La larvene utvikle seg til modne voksne til det er en overflod av egg i ormer og lagt på platene. Vask platene med buffer for å samle egg og ormer.
Deretter erstatter du bufferen med blekemiddelløsning som løser opp voksne ormer. Beskyttet av eggeskallet, vil embryoer overleve denne behandlingen, selv om de vil være på forskjellige stadier av utviklingen. Erstatt deretter blekemiddelet med buffer og la embryoene utvikle seg. Når larver klekker seg fra eggeskallene i fravær av mat, vil utviklingen pause på første larvestadium.
Overfør larvene til plater med mat for å gjenoppta utviklingen. Dette vil stimulere synkron progresjon gjennom de resterende larvestadiene.
Når ormer når det siste larvestadiet, flytt dem til plater med mat og FUdR, en DNA-syntesehemmer som forhindrer produksjon av avkom. Fortsatt utvikling i nærvær av FUdR produserer en populasjon av sterile voksne ormer. I dette eksperimentet vil vi synkronisere en befolkning av nematoden C. elegans.
-Til å begynne med, overfør L4 larver av ønsket genetisk bakgrunn til en nyseedet plen av Escherichia coli på nematode vekstmedier eller NGM-plater. Bruk minst to 100 millimeter eller tre 60 millimeter plater for hver stamme.
Inkuber ormene ved riktig veksttemperatur i tre til fire dager eller til platene er konsentrert med et stort antall egg og gravid ormer. Vask eggene og ormene av platene ved hjelp av omtrent seks milliliter M9 buffer per 100 millimeter plate nematoder. Bruk glass Pasteur pipetter, overfør egg og ormer til individuelle 15 milliliter sentrifuger rør for hver stamme. Snurr disse rørene ned i tre minutter ved 6180 g.
Etter sentrifugering aspirerer du M9-bufferen og beholder bare dyret og eggpellet. Tilsett tre til fire milliliter blekemiddelløsning til hvert rør og periodisk virvel i seks minutter.
Tilsett deretter M9 buffer for å fylle hvert rør og spinn på 6,180 g i ett minutt. Aspirer supernatanten og gjenta denne vasken med M9 tre ganger.
Etter vasken flytter du eggpellet til et friskt 15 milliliterrør som inneholder omtrent ni milliliter M9-buffer. Synkroniser de nyutviklede ormene ved å nøtte ved 20 grader Celsius i 16 til 48 timer.
Etter å ha snurret disse rørene ned på 6180 g i 1,5 minutter, legg de synkroniserte L1-dyrene ned på en nyseedet plen med OP50 på individuelle NGM-plater. Hold platene på 20 grader Celsius til dyrene når L4 larvalstadiet etter ca. 42 timer. På dette tidspunktet, bruk en platina pick for å flytte L4 larver til OP50 frø NGM plater som inneholder 0,5 milligram per milliliter FUdR for å hindre dem i å produsere avkom.
