Sincronização de Nematode: Um método para obter populações de vermes em estágios idênticos de desenvolvimento

-Comece colocando vermes auto-fertilizadores em seu último estágio larval em placas semeadas com uma fonte de alimento bacteriana. Permita que as larvas se desenvolvam em adultos maduros até que haja uma abundância de ovos dentro dos vermes e colocados nas placas. Lave as placas com tampão para coletar os ovos e vermes.

Em seguida, substitua o tampão por uma solução alvejante que dissolve vermes adultos. Protegidos pela casca de ovos, os embriões sobreviverão a este tratamento, embora estejam em diferentes estágios de desenvolvimento. Em seguida, substitua o alvejante por tampão e permita que os embriões se desenvolvam. À medida que as larvas eclodem de suas cascas de ovos na ausência de alimentos, o desenvolvimento fará uma pausa na primeira fase larval.

Transfira as larvas para pratos com alimentos para retomar o desenvolvimento. Isso estimulará a progressão síncroníncro por meio dos demais estágios larvais.

Quando os vermes chegarem ao último estágio larval, mova-os para pratos com comida e FUdR, um inibidor de síntese de DNA que impede a produção de descendentes. O desenvolvimento contínuo na presença de FUdR produz uma população de vermes adultos estéreis. Neste experimento, vamos sincronizar uma população do nematode C. elegans.

-Para começar, transfira larvas L4 de fundos genéticos desejados para um gramado recém-semeado de Escherichia coli em mídia de crescimento nematode ou placas de NGM. Use pelo menos duas placas de 100 milímetros ou três de 60 milímetros para cada cepa.

Incubar os vermes na temperatura de crescimento apropriada por três a quatro dias ou até que as placas estejam concentradas com um grande número de ovos e vermes gravid. Lave os ovos e vermes das placas usando aproximadamente seis mililitros de tampão M9 por placa de 100 milímetros de nematoides. Usando pipetas pasteur de vidro, transfira os ovos e vermes em tubos individuais de centrífugas de 15 mililitros para cada cepa. Gire esses tubos por três minutos a 6.180 g.

Após a centrifugação, aspire o tampão M9 retendo apenas a pelota animal e ovo. Adicione três a quatro mililitros de solução alvejante a cada tubo e vórtice intermitente por seis minutos.

Em seguida, adicione o tampão M9 para encher cada tubo e gire a 6.180 g por um minuto. Aspire o supernaste e repita esta lavagem com M9 três vezes.

Após a lavagem, mova a pelota de ovo para um tubo fresco de 15 mililitros contendo aproximadamente nove mililitros de tampão M9. Sincronize os vermes recém-eclodidos por nozes a 20 graus Celsius por 16 a 48 horas.

Depois de girar esses tubos a 6.180 g por 1,5 minutos, coloque os animais L1 sincronizados em um gramado recém-semeado de OP50 em placas ngm individuais. Mantenha as placas a 20 graus Celsius até que os animais atinjam o estágio larval L4 após aproximadamente 42 horas. Neste momento, use uma picareta de platina para mover as larvas L4 para placas de GNM semeadas OP50 contendo 0,5 miligramas por mililitro de FUdR para evitar que produzam progênitos.