Синхронизация нематод: метод получения популяций червей на идентичных стадиях развития

-Начните с размещения самоудобряющихся червей в их последней личиновой стадии на пластинах, посеянных с бактериальным источником пищи. Разрешить личинки развиваться в зрелых взрослых, пока есть обилие яиц в червей и положил на пластины. Вымойте пластины с буфером для сбора яиц и червей.

Далее замените буфер раствором отбеливателя, который растворяет взрослых червей. Защищенные яичной скорлупой, эмбрионы переживут это лечение, хотя они будут на разных стадиях развития. Затем замените отбеливатель буфером и позвольте эмбрионам развиваться. Поскольку личинки вылупляются из яичной скорлупы при отсутствии пищи, развитие будет приостановлено на первом этапе личинок.

Передача личинок на тарелки с пищей, чтобы возобновить развитие. Это будет стимулировать синхронное прогрессирование через оставшиеся личиночиночный этапов.

Когда черви достигают последней стадии личинки, переместить их в тарелки с пищей и FUdR, ингибитор синтеза ДНК, который предотвращает производство потомства. Продолжение развития в присутствии FUdR производит популяцию стерильных взрослых червей. В этом эксперименте мы синхронизируем популяцию нематод C. elegans.

-Для начала, передача L4 личинок желаемого генетического фона на свежесеянной лужайке Escherichia coli на нематод роста средств массовой информации или NGM пластин. Используйте по крайней мере две 100-миллиметровые или три 60-миллиметровые пластины для каждого штамма.

Инкубировать червей при соответствующей температуре роста в течение трех-четырех дней или до тех пор, пока пластины сосредоточены с большим количеством яиц и гравийных червей. Вымойте яйца и червей с пластин, используя примерно шесть миллилитров буфера M9 на 100 миллиметров пластины нематод. Используя стеклянные пипетки Pasteur, перенесите яйца и червей в отдельные 15 миллилитровых центрифуг для каждого штамма. Спин эти трубы вниз в течение трех минут на 6180 г.

После центрифугации, аспирировать из буфера M9 сохраняя только животное и яйцо гранулы. Добавьте три-четыре миллилитров раствора отбеливателя в каждую трубку и периодически вихрь в течение шести минут.

Затем добавьте буфер M9, чтобы заполнить каждую трубку и спина на 6180 г в течение одной минуты. Аспирировать супернатант и повторить эту стирку с M9 три раза.

После мытья перемести яичные гранулы в свежую 15-миллилитровую трубку, содержащую примерно девять миллилитров буфера M9. Синхронизировать свежевылупившихся червей, орехи при 20 градусах по Цельсию в течение 16 до 48 часов.

После вращения этих трубок вниз на 6180 г в течение 1,5 минут, положить синхронизированных L1 животных вниз на свежесеянной лужайке OP50 на отдельных пластин NGM. Держите пластины на 20 градусов по Цельсию, пока животные не достигнут стадии личинки L4 примерно через 42 часа. В это время используйте платиновый выбор для перемещения личинок L4 в семенные NGM-пластины OP50, содержащие 0,5 миллиграмма на миллилитр FUdR, чтобы предотвратить их производство потомства.