Drosophila Grave og tunneling Assay: En metode til at vurdere væv hypoxi i Fly Larver

- At oprette embryon indsamling bur, skal du bruge druesaft agar plader suppleret med frisk gær pasta og placere pladerne på bure, der indeholder mandlige og kvindelige Drosophila fluer af den relevante genotype. Lugten fra gær og druesaft er attraktiv og fremmer æglægning af hunnerne. Tillad æglægning i en tidsindstillet periode. Fjern derefter de voksne og inkuber embryopladerne i 24 timer for at opnå først instar larver. Overfør derefter forsigtigt et par individuelle larver fra druesaftpladen på en agar-kun testplade, hvor et hul i agaren i midten af pladen blev skåret ud og fyldt med gær pasta.

Unge larver skal fodre for at få kropsvægt til at udvikle sig, så de graver sig i fødekilden, gærpastaen. Når de udvikler sig, går larver ind i en vandrefase og tunnel væk fra maden for at opsøge et sted til hvalp. For at vurdere hypoxi skal du undersøge tunnelmønstrene larver dannes i substratet. Mangel eller utilstrækkelig tunneling er et tegn på iltmangel.

- Opsæt kontrol og eksperimentelle genetiske kors i æg lægge retter som beskrevet i tekstprotokollen. Hold fluer i mørke i mindst to dage før start timet æg samlinger. For timet æg indsamling, overføre de voksne til nye drue agar plader dekoreret med en frisk smøre af gær pasta tidligt på dagen og give de voksne til at lægge æg på pladerne i fire timer.

Dernæst inkubere de fire timers indsamlingsplader natten over ved 25 grader Celsius. Den næste eftermiddag vil de fleste larver have udklækket. Planlæg at have mindst 50 for hver eksperimentel gruppe.

For en enkelt kørsel af analysen, forberede mindst fem assay plader pr eksperimentel gruppe. Tilsæt 16 gram flyve agar i 700 milliliter deioniseret vand ved opvarmning. Varm agaropløsningen, indtil den er næsten helt opløst. Tilsæt derefter Nipagen-opløsning til agaropløsningen og opvarm, indtil agaren er helt opløst. Afkøl agaropløsningen kort, læg derefter 10 centimeter plader med 15 milliliter agaropløsning. Når agargelerne sættes låg på pladerne og lad dem tørre ved stuetemperatur i et par timer eller natten over.

Hærdet agar skal være fast at røre ved og modstå smuldre, når stykker skæres ud af det. Når agaren er hærdet, skal du bruge en 1,5 centimeter korkborer til at lave et centralt hul i agargelen i hver plade. Fyld derefter hullerne pænt med frisk gærpasta.

For at overføre larverne til analysepladen skal du lave et simpelt værktøj. Bøj en kurve ind i spidsen af en plastmikrospatel og dyp spidsen i gærpasta for at gøre den klæbende til larver. Nu afhentes de første instar larver individuelt og læg dem på agarpladen tæt på madhøjen. For hver eksperimentel gruppe skal du forberede mindst fem plader hver med 10 larver.

For at sikre reproducerbarhed mellem assay replikater er det afgørende, at der kun placeres 10 larver på hver analyseplade. Sørg for at kontrollere analysepladen omhyggeligt for at fastslå, at en og kun en larve overføres, hver gang du leverer en larve med mikrospatulaspidsen.

Når pladen er indlæst, mærke det, dække det, så læg den i mørke med låget side op ved stuetemperatur. Undersøg hver plade dagligt, indtil alle larverne er døde eller pupated. Her er eksempler på plader til en vild type stamme fra dag to til dag otte af analysen. På dag to, larver er begravet i mad og ingen tunneling opstår. Tunneling begynder på dag tre og når et maksimum mellem dage fem og otte som larver ophøre med at vandre og poppe i deres tunneler.

Overfør forsigtigt pupperne med en bøjet drillepind til en drueplade, og tæl om ønsket, hvor mange pupper der er eclose. Vær opmærksom på pupperdannelse og evaluer pupper for abnormiteter.