Drosophila ( Drosophila ) Analyse des terriers et des tunnels : une méthode pour évaluer l’hypoxie tissulaire chez les larves de mouches

- Pour mettre en place la cage de collecte d’embryons, utilisez des assiettes d’agar de jus de raisin complétées par de la pâte de levure fraîche et placez les assiettes sur des cages contenant des mouches mâles et femelles de Drosophila du génotype approprié. L’odeur de la levure et du jus de raisin est attrayante et favorise la ponte par les femelles. Autoriser la ponte pendant une période de temps. Puis retirer les adultes et incuber les plaques embryonnaires pendant 24 heures pour obtenir les larves de premier stade. Puis transférer délicatement quelques larves individuelles de la plaque de jus de raisin sur une plaque d’essai à l’agar seulement où un trou dans l’agar au centre de la plaque a été découpée et remplie de pâte de levure.

Les jeunes larves doivent se nourrir pour prendre du poids corporel pour se développer, de sorte qu’elles creusent dans la source alimentaire, la pâte de levure. Au fur et à mesure qu’elles se développent, les larves entrent dans une phase d’errance et creusent un tunnel loin de la nourriture pour chercher un site de pupation. Pour évaluer l’hypoxie, examiner les schémas de tunnelage que les larves forment dans le substrat. Le manque ou l’insuffisance du tunnel est un signe de privation d’oxygène. Dans le protocole d’exemple, nous verrons comment mettre en place l’analyse des terriers et des tunnels.

- Mettre en place les croisements génétiques de contrôle et expérimentaux dans les plats pondant des œufs comme décrit dans le protocole du texte. Gardez les mouches dans l’obscurité pendant au moins deux jours avant de commencer les collectes d’œufs à temps. Pour la collecte des œufs à temps, transférez les adultes dans de nouvelles assiettes d’agar de raisin décorées d’un frottis frais de pâte de levure tôt dans la journée et permettez aux adultes de pondre des œufs dans les assiettes pendant quatre heures. Après quatre heures, transférez les adultes dans des assiettes fraîches d’agar de raisin.

Ensuite, incubez les plaques de collecte de quatre heures pendant la nuit à 25 degrés Celsius. D’ici l’après-midi suivant, la plupart des larves auront éclos. Prévoyez en avoir au moins 50 pour chaque groupe expérimental.

Pour une seule course de l’essai, préparer au moins cinq plaques d’analyse par groupe expérimental. Ajouter 16 grammes d’agar volant dans 700 millilitres d’eau déionisée par chauffage. Préparer 17,5 millilitres Nipagen dans 95% d’éthanol. Chauffer la solution d’agar jusqu’à ce qu’elle soit presque complètement dissoute. Puis ajouter la solution Nipagen à la solution d’agar et chauffer jusqu’à ce que l’agar se dissolve complètement. Refroidir brièvement la solution d’agar, puis les charger de 10 centimètres avec 15 millilitres de la solution d’agar. Une fois que les gels d’agar, mettre les couvercles sur les plaques et les laisser sécher à température ambiante pendant quelques heures ou pendant la nuit.

L’agar durci doit être ferme au toucher et résister à l’effritement lorsque des morceaux sont coupés de celui-ci. Une fois que l’agar a guéri, utilisez un foreur de liège de 1,5 centimètre pour faire un trou central dans le gel d’agar dans chaque assiette. Puis remplissez les trous soigneusement avec de la pâte de levure fraîche.

Pour transférer les larves à la plaque d’essai, faire un outil simple. Pliez une courbe dans la pointe d’une microspatule en plastique et trempez la pointe dans la pâte de levure pour la rendre adhésive aux larves. Maintenant, ramasser les premières larves de stade individuellement et les placer sur la plaque d’agar près du monticule alimentaire. Pour chaque groupe expérimental, préparer au moins cinq assiettes chacune avec 10 larves.

Pour assurer la reproductibilité entre les répliques d’essai, il est essentiel que seulement 10 larves soient placées sur chaque plaque d’essai. Assurez-vous de vérifier soigneusement la plaque d’analyse pour déterminer qu’une seule et unique larve est transférée chaque fois que vous livrez une larve avec la pointe de la microspatule.

Une fois que la plaque est chargée, étiquetez-la, couvrez-la, puis placez-la dans l’obscurité avec le côté couvercle vers le haut à température ambiante. Examinez chaque plaque tous les jours jusqu’à ce que toutes les larves soient mortes ou pupées. Voici des exemples de plaques pour une souche de type sauvage du deuxième au huitième jour de l’essai. Le deuxième jour, les larves sont enterrées dans la nourriture et aucun tunnel ne se produit. Le tunneling commence le troisième jour et atteint un maximum entre les jours cinq et huit pendant que les larves cessent d’errer et de se puper dans leurs tunnels.

Transférer délicatement les pupes à l’aide d’une aiguille de taquinerie pliée dans une assiette de raisin et, si désiré, compter le nombre d’anguizés de pupes. Prendre note de la formation de pupes et évaluer les pupes pour décemer les anomalies.