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Encyclopedia of Experiments: Biology

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Drosophila Burrowing and Tunneling Assay

 
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Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: A Method to Assess Tissue Hypoxia in Fly Larvae

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- Um den Embryo-Entnahmekäfig einzurichten, verwenden Sie Traubensaft-Agarplatten, ergänzt mit frischer Hefepaste, und legen Sie die Teller auf Käfige, die männliche und weibliche Drosophila-Fliegen des entsprechenden Genotyps enthalten. Der Geruch aus der Hefe und Traubensaft ist attraktiv und fördert die Eiablage durch die Weibchen. Lassen Sie die Eiablage für einen bestimmten Zeitraum. Dann entfernen Sie die Erwachsenen und bebrüten die Embryo-Platten für 24 Stunden, um erste Instar Larven zu erhalten. Dann sanft ein paar einzelne Larven von der Traubensaftplatte auf eine Agar-nur-Testplatte, wo ein Loch in der Agar in der Mitte der Platte ausgeschnitten und mit Hefepaste gefüllt.

Junge Larven müssen sich ernähren, um das Körpergewicht zu gewinnen, um sich zu entwickeln, so dass sie in der Nahrungsquelle, der Hefepaste, graben. Während sie sich entwickeln, betreten Larven eine Wanderphase und tunneln weg von der Nahrung, um einen Ort für die Verpfupation zu suchen. Um die Hypoxie zu beurteilen, untersuchen Sie die Tunnelmuster Larven im Substrat. Mangel oder unzureichende Tunnelbildung ist ein Zeichen von Sauerstoffmangel. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie wir die Zerlegung sätfieren.

- Richten Sie die Kontroll- und experimentellen genetischen Kreuze in Eier-Lay-Gerichten ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Halten Sie die Fliegen mindestens zwei Tage in der Dunkelheit, bevor Sie mit den zeitgesteuerten Eiersammlungen beginnen. Für die zeitgesteuerte Eiersammlung, übertragen Sie die Erwachsenen auf neue Traubenagarteller, die früh am Tag mit einem frischen Hefepastenabstrich verziert sind, und lassen Sie die Erwachsenen vier Stunden lang Eier auf die Teller legen.

Als nächstes inkubieren Sie die vierstündigen Sammelplatten über Nacht bei 25 Grad Celsius. Bis zum nächsten Nachmittag werden die meisten Larven geschlüpft sein. Planen Sie, mindestens 50 für jede versuchsweise Gruppe zu haben.

Für einen einzigen Lauf des Assays, bereiten Sie mindestens fünf Assay-Platten pro experimentelle Gruppe. Fügen Sie 16 Gramm Fliegenagar in 700 Milliliter entionisiertes Wasser durch Erhitzen. Bereiten Sie 17,5 Milliliter Nipagen in 95% Ethanol vor. Erhitzen Sie die Agarlösung, bis sie fast vollständig gelöst ist. Dann fügen Sie die Nipagen-Lösung in die Agarlösung ein und erhitzen Sie, bis sich der Agar vollständig auflöst. Kühlen Sie die Agarlösung kurz ab, dann 10 Zentimeter Platten mit 15 Millilitern der Agar-Lösung laden. Sobald die Agar-Gele, Die Deckel auf die Teller legen und sie bei Raumtemperatur für ein paar Stunden oder über Nacht trocknen lassen.

Gehärteter Agar muss fest an der Berührung sein und dem Zerbröckeln widerstehen, wenn Stücke ausgeschnitten werden. Sobald der Agar ausgehärtet ist, verwenden Sie einen 1,5 Zentimeter langen Korkbohrer, um ein zentrales Loch im Agargel in jeder Platte zu machen. Füllen Sie die Löcher dann ordentlich mit frischer Hefepaste.

Um die Larven auf die Assayplatte zu übertragen, machen Sie ein einfaches Werkzeug. Biegen Sie eine Kurve in die Spitze eines Plastikmikrospatulas und tauchen Sie die Spitze in Hefepaste, um sie zu Denlarven kleben zu lassen. Nehmen Sie nun die ersten Instar-Larven einzeln auf und legen Sie sie auf die Agarplatte in der Nähe des Futterhügels. Für jede Versuchsgruppe bereiten Sie mindestens fünf Platten mit jeweils 10 Larven zu.

Um die Reproduzierbarkeit zwischen den Assay-Replikationen zu gewährleisten, ist es wichtig, dass nur 10 Larven auf jeder Assayplatte platziert werden. Achten Sie darauf, die Assayplatte sorgfältig zu überprüfen, um festzustellen, dass eine und nur eine Larve jedes Mal übertragen wird, wenn Sie eine Larve mit der Mikrospatulaspitze liefern.

Sobald die Platte geladen ist, Etikettieren Sie es, bedecken Sie es, dann legen Sie es in der Dunkelheit mit der Deckelseite nach oben bei Raumtemperatur. Untersuchen Sie jede Platte täglich, bis alle Larven gestorben oder verpupiert sind. Hier sind Beispiele für Platten für eine wilde Art Belastung von Tag zwei bis Tag acht des Tests. Am zweiten Tag werden Larven in der Nahrung begraben und keine Tunnelung tritt auf. Tunneling beginnt am dritten Tag und erreicht ein Maximum zwischen den Tagen fünf und acht als Larven aufhören zu wandern.

Übertragen Sie die Pupae vorsichtig mit einer gebogenen Neckischnadel auf einen Traubenteller und zählen Sie auf Wunsch, wie viele Pupae ausschließen. Beachten Sie die Bildung von Pupas und bewerten Sie Diepupae auf Anomalien.

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