Drosofilia Saggio di scavare e tunneling: un metodo per valutare l'ipossia tissutale nelle larve di mosca

- Per allevare la gabbia di raccolta degli embrioni, utilizzare piastre di agar di succo d'uva integrate con pasta di lievito fresco e posizionare le piastre su gabbie contenenti mosche Drosophila maschili e femminili del genotipo appropriato. L'odore del lievito e del succo d'uva è attraente e favorisce la deposizione delle uova da parte delle femmine. Consentire la deposizione delle uova per un periodo a tempo. Rimuovere quindi gli adulti e incubare le piastre embrionale per 24 ore per ottenere prima larve instar. Quindi trasferire delicatamente alcune singole larve dal piatto del succo d'uva su un piatto di prova solo agar in cui un buco nell'agar al centro del piatto è stato tagliato e riempito con pasta di lievito.

Le giovani larve devono nutrirsi per aumentare il peso corporeo per svilupparsi, quindi scavano nella fonte di cibo, nella pasta di lievito. Man mano che si sviluppano, le larve entrano in una fase errante e si allontanano dal tunnel lontano dal cibo per cercare un sito per la pupa. Per valutare l'ipossia, esaminare i modelli di tunneling che le larve formano nel substrato. La mancanza o l'insufficiente tunneling è un segno di privazione di ossigeno. Nel protocollo di esempio, vedremo come impostare il saggio di scavare e tunneling.

- Impostare il controllo e le croci genetiche sperimentali nei piatti di deposizione delle uova come descritto nel protocollo di testo. Tenere le mosche al buio per almeno due giorni prima dell'inizio delle raccolte di uova a tempo. Per la raccolta delle uova a tempo, trasferire gli adulti in nuovi piatti di agar d'uva decorati con uno striscio fresco di pasta di lievito all'inizio della giornata e consentire agli adulti di deporre le uova sui piatti per quattro ore. Dopo quattro ore, trasferire gli adulti in piatti di agar d'uva fresca.

Successivamente, incubare le piastre di raccolta di quattro ore durante la notte a 25 gradi Celsius. Entro il pomeriggio successivo, la maggior parte delle larve si sarà schiusa. Pianificare di averne almeno 50 per ogni gruppo sperimentale.

Per una singola corsa del saggio, preparare almeno cinque piastre di dosaggio per gruppo sperimentale. Aggiungere 16 grammi di agar mosca in 700 millilitri di acqua deionizzata riscaldando. Preparare 17,5 millilitri Nipagen nel 95% di etanolo. Riscaldare la soluzione di agar fino a quando non è quasi completamente sciolta. Aggiungere quindi la soluzione di Nipagen alla soluzione di agar e riscaldare fino a quando l'agar non si dissolve completamente. Raffreddare brevemente la soluzione di agar, quindi caricare piastre di 10 centimetri con 15 millilitri della soluzione di agar. Una volta che l'agar gels, mettere i coperchi sui piatti e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per alcune ore o durante la notte.

L'agar stagionato deve essere sodo al tatto e resistere allo sgretolamento quando i pezzi vengono tagliati. Una volta che l'agar è guarito, utilizzare una borsista di sughero di 1,5 centimetri per creare un foro centrale nel gel di agar in ogni piastra. Quindi riempire i fori in modo ordinato con pasta di lievito fresca.

Per trasferire le larve nella piastra di dosaggio, creare un semplice strumento. Piegare una curva nella punta di una microspapla di plastica e immergere la punta nella pasta di lievito per renderla adesiva alle larve. Ora raccogliete singolarmente le prime larve instar e posizionatele sulla piastra di agar vicino al tumulo alimentare. Per ogni gruppo sperimentale, preparate almeno cinque piatti ciascuno con 10 larve.

Per garantire la riproducibilità tra le repliche del saggio, è fondamentale che solo 10 larve siano posizionate su ogni piastra di dosaggio. Assicurarsi di controllare attentamente la piastra di dosaggio per determinare che una sola larva viene trasferita ogni volta che si consegna una larva con la punta della microspatta.

Una volta caricata la piastra, etichettarlo, coprirlo, quindi posizionarlo nell'oscurità con il lato del coperchio verso l'alto a temperatura ambiente. Esaminare ogni piatto ogni giorno fino a quando tutte le larve sono morte o impiossesse. Ecco esempi di piatti per un ceppo di tipo selvatico dal secondo al secondo giorno del saggio. Il secondo giorno, le larve vengono sepolte nel cibo e non si verifica alcun tunneling. Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra i cinque e gli otto giorni quando le larve cessano di vagare e impuparsi nei loro tunnel. Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra i giorni cinque e otto quando le larve cessano di vagare e impupano nei loro tunnel. Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra i giorni cinque e otto quando le larve cessano di vagare e impupano nei loro tunnel. Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra i cinque e gli otto giorni mentre le larve cessano di vagare e impupano nei loro tunnel. Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra i cinque e gli otto giorni mentre le larve cessano di vagare e si impupano nei loro tunnel. Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra i cinque e gli otto giorni quando le larve cessano di vagare e impupano nei loro tunnel. Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra i cinque e gli otto giorni mentre le larve

Trasferire con cura le pupe con un ago da presa in giro piegato su un piatto d'uva e, se lo si desidera, contare quante pupe eclose. Prendere nota della formazione di pupe e valutare le pupe per le anomalie.