Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For å sette opp embryooppsamlingsburet, bruk druejuice agarplater supplert med fersk gjærpasta og legg platene på bur som inneholder mannlige og kvinnelige Drosophila-fluer av riktig genotype. Lukten fra gjær og druejuice er attraktiv og fremmer egglegging av hunnene. Tillat egglegging i en tidsberegnet periode. Fjern deretter de voksne og inkuber embryoplatene i 24 timer for å få første instar larver. Overfør deretter forsiktig noen få individuelle larver fra druejuiceplaten til en agar-bare testplate der et hull i agaren i midten av platen ble kuttet ut og fylt med gjærpasta.
Unge larver må mate for å få kroppsvekt til å utvikle seg, så de graver seg inn i matkilden, gjærpastaen. Når de utvikler seg, går larver inn i en vandrende fase og tunnelerer bort fra maten for å oppsøke et sted for pupering. For å vurdere hypoksi, undersøk tunnelmønstrene larver dannes i substratet. Mangel eller utilstrekkelig tunnelering er et tegn på oksygenmangel. I eksempelprotokollen vil vi se hvordan vi skal sette opp burrowing og tunneling assay.
- Sett opp kontrollen og eksperimentelle genetiske kryss i eggleggingsretter som beskrevet i tekstprotokollen. Hold fluene i mørke i minst to dager før starttidsdømte eggsamlinger. For tidsberegnet eggsamling, overfør de voksne til nye drue agarplater dekorert med et friskt smør av gjærpasta tidlig på dagen og la de voksne legge egg på platene i fire timer. Etter fire timer, overfør de voksne til fersk drue agarplater.
Deretter inkuberer du de fire timer lange oppsamlingsplatene over natten ved 25 grader Celsius. Innen neste ettermiddag vil de fleste larvene ha klekket ut.
For en enkelt kjøring av analysen, forbered minst fem analyseplater per eksperimentell gruppe. Tilsett 16 gram flyagar i 700 milliliter deionisert vann ved oppvarming. Forbered 17,5 milliliter Nipagen i 95% etanol. Varm agaroppløsningen til den er nesten helt oppløst. Tilsett deretter Nipagen-oppløsningen i agarløsningen og varm til agaren er helt oppløst. Avkjøl agaroppløsningen kort, last deretter 10 centimeter plater med 15 milliliter agaroppløsningen. Når agargelene er helt oppløses.
Herdet agar må være fast å ta på og motstå smuldre når brikkene er kuttet ut av den. Når agaren er herdet, bruk en 1,5 centimeter korkborer for å lage et sentralt hull i agargelen i hver tallerken. Fyll deretter hullene pent med fersk gjærpasta.
For å overføre larvene til analyseplaten, lag et enkelt verktøy. Bøy en kurve inn i spissen av en plastmikrospatula og dypp spissen i gjærpasta for å gjøre den lim til larver. Nå plukker du opp de første instar larver individuelt og legger dem på agarplaten nær mathaugen. For hver eksperimentell gruppe, lag minst fem plater hver med 10 larver.
For å sikre reproduserbarhet mellom analysene replikerer, er det viktig at bare 10 larver plasseres på hver analyseplate. Sørg for å sjekke analyseplaten nøye for å bestemme at en og bare en larve overføres hver gang du leverer en larve med mikrospatulaspissen.
Når platen er lastet, merk den, dekk den, legg den deretter i mørke med lokksiden opp ved romtemperatur. Undersøk hver tallerken daglig til alle larvene er døde eller pupert. Her er eksempler på plater for en vill type belastning fra dag to til dag åtte av analysen. På dag to blir larver begravet i mat og ingen tunnelering skjer. Tunnelering begynner på dag tre og når maksimalt mellom dager fem og åtte når larver slutter å vandre og puperer.
Overfør forsiktig puppene med en bøyd ertende nål til en drueplate, og om ønskelig, tell hvor mange pupper eclose. Legg merke til pupperdannelse og vurder pupper for abnormiteter.
