Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Para montar a gaiola de coleta de embriões, utilize placas de ágar de suco de uva suplementadas com pasta de levedura fresca e coloque as placas em gaiolas contendo moscas drosophila masculinas e fêmeas do genótipo apropriado. O odor do fermento e do suco de uva é atraente e promove a colocação de ovos pelas fêmeas. Permitir a colocação de ovos por um período cronometrado. Em seguida, remova os adultos e incuba as placas de embrião por 24 horas para obter as primeiras larvas instar. Em seguida, transfira suavemente algumas larvas individuais da placa de suco de uva para uma placa de teste apenas de ágar onde um buraco no ágar no centro do árido. placa foi cortada e preenchida com pasta de levedura.
Larvas jovens devem se alimentar para ganhar peso corporal para se desenvolver, para que se inscrevam na fonte de alimento, a pasta de levedura. À medida que se desenvolvem, as larvas entram em uma fase errante e túnel longe do alimento para procurar um local para a pupação. Para avaliar a hipóxia, examinar os padrões de túnel larvas formam-se no substrato. Falta ou túnel insuficiente é um sinal de privação de oxigênio.
- Configurar o controle e as cruzes genéticas experimentais em pratos de ovo, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha as moscas na escuridão por pelo menos dois dias antes de iniciar coletas de ovos cronometrados. Para a coleta de ovos cronometrados, transfira os adultos para novas placas de ágar de uva decoradas com uma mancha fresca de pasta de levedura no início do dia e permita que os adultos coloquem ovos nas placas por quatro horas.
Em seguida, incubar as placas de coleta de quatro horas durante a noite a 25 graus Celsius. Até a tarde seguinte, a maioria das larvas terá eclodido.
Para uma única execução do ensaio, prepare pelo menos cinco placas de ensaio por grupo experimental. Adicione 16 gramas de ágar voador em 700 mililitros de água deionizada pelo aquecimento. Prepare 17,5 mililitros Nipagen em 95% de etanol. Aqueça a solução de ágar até que esteja quase completamente dissolvida. Em seguida, adicione a solução Nipagen à solução de ágar e aqueça até que o ágar se dissolva completamente. Esfrie a solução do ágar brevemente, depois carregue placas de 10 centímetros com 15 mililitros da solução de ágar. Uma vez que os géis de ágar, coloquem tampas nas placas e deixem-nas secar à temperatura ambiente por algumas horas ou durante a noite.
O ágar curado deve ser firme ao toque e resistir ao desmoronamento quando as peças forem cortadas dele. Uma vez que o ágar tenha curado, use um borer de cortiça de 1,5 centímetro para fazer um orifício central no gel de ágar em cada placa. Em seguida, encha os orifícios com pasta de levedura fresca.
Para transferir as larvas para a placa de ensaio, faça uma ferramenta simples. Dobre uma curva na ponta de uma microspatula plástica e mergulhe a ponta em pasta de levedura para torná-la adesiva às larvas. Agora pegue as primeiras larvas instar individualmente e coloque-as na placa de ágar perto do monte de alimentos. Para cada grupo experimental, prepare pelo menos cinco pratos cada um com 10 larvas.
Para garantir a reprodutibilidade entre as réplicas de ensaio, é fundamental que apenas 10 larvas sejam colocadas em cada placa de ensaio. Certifique-se de verificar cuidadosamente a placa de ensaio para determinar que uma e apenas uma larva é transferida cada vez que você entrega uma larva com a ponta da microspatula.
Uma vez que a placa é carregada, rotulá-lo, cobri-lo, em seguida, colocá-lo na escuridão com o lado da tampa para cima em temperatura ambiente. Examine cada prato diariamente até que todas as larvas tenham morrido ou filhotes. Aqui estão exemplos de placas para uma cepa tipo selvagem do segundo dia até o oitavo dia do ensaio. No segundo dia, larvas são enterradas em alimentos e nenhum túnel ocorre.
Transfira cuidadosamente a pupa com uma agulha de provocação dobrada para uma placa de uva e, se desejar, conte quantas pupas eclose. Tome nota da formação de pupas e avalie pupas para anormalidades.
