Дрозофила Берроуинг и туннелирование анализ: метод для оценки гипоксии тканей в Fly Larvae

- Для настройки клетки сбора эмбрионов, использовать виноградный сок агар пластины, дополненные свежей дрожжевой пасты и поместить пластины на клетки, содержащие мужчин и женщин Drosophila мух соответствующего генотипа. Запах дрожжей и виноградного сока привлекателен и способствует откладываю яиц самками. Разрешить откладывать яйцо на период времени. Затем удалите взрослых и инкубировать пластины эмбриона в течение 24 часов, чтобы получить первые личинки звезды. Затем аккуратно перенесите несколько отдельных личинок из пластины виноградного сока на агар-только тестовую пластину, где отверстие в агаре в центре тарелка была вырезана и заполнена дрожжевой пастой.

Молодые личинки должны питаться, чтобы набрать вес тела, чтобы развиваться, поэтому они норы в источник пищи, дрожжевой пасты. Как они развиваются, личинки вступают в блуждающую фазу и туннель от пищи, чтобы искать место для pupation. Для оценки гипоксии, изучить туннельные модели личинок форме в субстрате. Отсутствие или недостаточное туннелирование является признаком лишения кислорода.

- Настройка контроля и экспериментальных генетических крестов в яичной посуде отложить, как описано в текстовом протоколе. Держите мух в темноте, по крайней мере за два дня до начала время сбора яиц. Для сбора яиц, передача взрослых на новые виноградные агар тарелки украшены свежим мазком дрожжевой пасты в начале дня и позволяют взрослым откладывать яйца на тарелках в течение четырех часов.

Далее, инкубировать четыре часа сбора пластин на ночь при 25 градусах по Цельсию. К следующему дню, большинство личинок вылупились.

Для одного запуска анализа, подготовить по крайней мере пять анализных пластин на экспериментальную группу. Добавить 16 граммов мухи агара в 700 миллилитров деионизированной воды при нагревании. Подготовка 17,5 миллилитров Nipagen в 95% этанола. Нагрейте агарный раствор, пока он почти полностью не растворится. Затем добавьте раствор Nipagen в агарный раствор и нагрейте до тех пор, пока агар полностью не растворится. Охладите агарный раствор кратко, затем загрузите 10 сантиметровых пластин 15 миллилитров агарного раствора. Как только агар гели, положите крышки на пластины и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение нескольких часов или на ночь.

Вылеченный агар должен быть твердым на ощупь и сопротивляться рушится, когда куски вырезаны из него. Как только агар вылечился, используйте 1,5 сантиметр пробки borer, чтобы сделать центральное отверстие в агар гель в каждой тарелке. Затем заполнить отверстия аккуратно со свежими дрожжевой пасты.

Чтобы перенести личинки на анализную пластину, сделайте простой инструмент. Согните кривую в кончике пластикового микроспатула и окуните кончик в дрожжевую пасту, чтобы сделать его клеем для личинок. Теперь возьмите первые личинки instar по отдельности и поместите их на агарную тарелку рядом с пищевой насыпью.

Для обеспечения воспроизводимости между анализом репликаций, очень важно, чтобы только 10 личинок помещаются на каждой анализной пластине. Не забудьте проверить анализ пластины тщательно, чтобы определить, что один и только одна личинка передается каждый раз, когда вы доставить личинку с микроспатула отзыв.

После того, как пластина загружается, этикетка его, покрыть его, а затем поместить его в темноте с крышкой вверх при комнатной температуре. Изучить каждую пластину ежедневно, пока все личинки умерли или окукливаются. Вот примеры пластин для дикого типа штамма со дня два по день восемь анализов.

Тщательно перенесите куколки с изогнутой дразня иглой на виноградную тарелку и при желании подсчитайте, сколько куколок выклюка. Обратите внимание на образование куколок и оцените куколок на аномалии.