Drosophila (olika betydelser) Grävning och tunnelanalys: En metod för att bedöma vävnadshypoxi i fluglarver

- För att sätta upp embryosamlingsburen, använd druvjuiceagarplattor kompletterade med färsk jästpasta och placera plattorna på burar som innehåller han- och honflugor av lämplig genotyp. Lukten från jästen och druvsaften är attraktiv och främjar äggläggning av honorna. Tillåt äggläggning under en tidsbetonad period. Ta sedan bort de vuxna och inkubera embryoplattorna i 24 timmar för att få första instar larverna. Överför sedan försiktigt några enskilda larver från druvjuiceplattan på en agar-endast testplatta där ett hål i agar i mitten av agaren i mitten av druvjuiceplattan försiktigt överförs till en agar-endast testplatta där ett hål i agar i mitten av agaren i mitten av druvjuiceplattan tallriken skars ut och fylldes med jästpasta.

Unga larver måste mata för att få kroppsvikt för att utvecklas, så de gräver i matkällan, jästpasta. När de utvecklas går larver in i en vandrande fas och tunnel bort från maten för att söka efter en plats för poppning.

- Ställ in kontroll- och experimentella genetiska kors i ägg lägg rätter enligt beskrivningen i textprotokollet.

Därefter inkuberar du de fyra timmars insamlingsplattorna över natten vid 25 grader Celsius.

För en enda körning av analysen, bered minst fem analysplattor per experimentell grupp. Tillsätt 16 gram flugagar i 700 milliliter avjoniserat vatten genom uppvärmning. Värm agarlösningen tills den är nästan helt upplöst. Tillsätt sedan Nipagen-lösningen till agarlösningen och värm tills agarn helt löser sig. Kyl agarlösningen kort, ladda sedan 10 centimeterplattor med 15 milliliter agarlösningen.

Härdad agar måste vara fast vid beröring och motstå att falla sönder när bitar skärs ut ur den. När agaren har härdat, använd en 1,5 centimeter korkborr för att göra ett centralt hål i agargelen i varje tallrik. Fyll sedan hålen snyggt med färsk jästpasta.

För att överföra larverna till analysplattan, gör ett enkelt verktyg.

För att säkerställa reproducerbarhet mellan analys replikat är det viktigt att endast 10 larver placeras på varje analysplatta.

När plattan är laddad, märk den, täck den, placera den sedan i mörker med locket upp i rumstemperatur. Undersök varje tallrik dagligen tills alla larver har dött eller poppats. Här är exempel på plattor för en vild typstam från dag två till dag åtta av analysen. På dag två är larverna begravda i mat och ingen tunnelning sker. Tunneling börjar på dag tre och når maximalt mellan dag fem och åtta larver slutar vandra och poppa i sina tunnlar.

Överför försiktigt popparna med en böjd retsticka till en druvplatta och om så önskas, räkna hur många puppar eclose. Notera poppbildning och utvärdera puppar för avvikelser.