Drosophila Männliche Zubehör Drüsensektion: Eine Methode, um sekundäre Zellen zu isolieren

- Entfernen Sie unter einem Dissektionsmikroskop und in Serum ergänzten Medien, entfernen Sie den Fortpflanzungstrakt von jeder Fliege mit Zangen. Zuerst entfernen Sie Teile des Verdauungstraktes, die den Fortpflanzungstrakt begleitet haben können. Um die Zubehördrüsen und den Ejakulationskanal zu isolieren, entfernen Sie die Hoden, die Ejakulationslampe und die Terminalia. Waschen Sie das Gewebe für ein bis zwei Minuten in PBS, um das Serum zu entfernen.

Um die Zellen innerhalb der Drüsen der Dissoziationslösung auszusetzen, halten Sie die Mitte jeder Drüse mit Zangen und schneiden Sie mit einem Paar scharfer Zange durch die Drüse. Entfernen Sie den proximalen Teil der Drüse und den Ejakulationskanal, um das distale Ende der Drüsen zu hinterlassen, die die seltene sekundäre Zellpopulation enthalten, die für die Sekretion von Proteinen verantwortlich ist, die an der Paarung beteiligt sind. Schließlich übertragen Sie die Zubehördrüsen spitzen in ein Mikrozentrifugenrohr zur Vorbereitung auf die Verdauung. Im folgenden Protokoll werden wir die Zubehördrüsen sezieren, um sekundäre Zellen für die Transkription zu isolieren.

- Vor Beginn des Verfahrens, schneiden und Flamme rund, breite 200 Mikroliter-Spitzen für den Umgang mit den Drüsen, und passieren Sie die Spitzenöffnung von mehreren 1000 Mikroliter Spitzen in der Nähe einer Flamme für weniger als eine Sekunde, um die Öffnungen zu verengen. Dann sortieren Sie die modifizierten Spitzen von schmaler zu breiter je nach ihrer Aspirationsgeschwindigkeit. Für Zubehör Drüsensektion, legen Sie 20 bis 25 männliche drosophila in einer Glasschale auf Eis und verwenden Sie Zange und ein Seziermikroskop, um den Fortpflanzungstrakt einer männlichen Fliege zu entfernen.

Löschen Sie das Zubehör Drüsenpaar von allen anderen Geweben, einschließlich der Hoden und Ejakulation Seutine, und übertragen Sie die Zubehördrüsen auf eine Glasplatte mit Serum ergänzt Medium bei Raumtemperatur. Wenn 20 Paar Zubehördrüsen gesammelt wurden, waschen Sie die Drüsen in einer Schale von PBS für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Wäsche, übertragen Sie die Drüsen auf frisch zubereitete Dissoziationslösung, und verwenden Sie scharfe Zangen unter einem Trennmikroskop, um die Mitte eines Drüsenlappens fest zu kneifen.

Schneiden Sie das Gewebe mit der scharfen Spitze mit einem zweiten Zangenpaar, um den proximalen Bereich der Zubehördrüse und den Ejakulationskanal vom Teil der Drüse zu trennen, der Sekundärzellen enthält. Verwenden Sie dann eine vornasse Flamme, die breit 200 Mikroliter Pipette Spitze gerundet, um die Drüsen auf ein 1,5 Milliliter Rohr zu übertragen.