Drosofilia Dissezione ghiandola accessoria maschile: un metodo per isolare le cellule secondarie

- Al microscopio a dissezione e nei mezzi integrati nel siero, rimuovere il tratto riproduttivo da ogni mosca con le forcep. In primo luogo, rimuovere parti del tratto digestivo che potrebbero aver accompagnato il tratto riproduttivo. Per isolare le ghiandole accessorie e il condotto eiaculaorio, rimuovere i teste, il bulbo eiaculatorio e la terminalia. Lavare il tessuto per uno o due minuti in PBS per rimuovere il siero. Quindi, trasferirlo in soluzione di dissociazione.

Per esporre le cellule all'interno delle ghiandole alla soluzione di dissociazione, tenere il centro di ogni ghiandola con le forcep e tagliare attraverso la ghiandola con un paio di forcep affilate. Rimuovere la porzione prossimale della ghiandola e il condotto eiaculatorio per lasciare dietro di sé l'estremità distale delle ghiandole contenenti la rara popolazione di cellule secondarie responsabili della secrezione di proteine coinvolte nell'accoppiamento. Infine, trasferire le punte della ghiandola accessoria a un tubo di micro centrifuga in preparazione alla digestione. Nel seguente protocollo, sezioneremo le ghiandole accessorie per isolare le cellule secondarie per l'analisi del trascrittoma.

- Prima di iniziare la procedura, tagliare e fiammare punte rotonde, larghe 200 microliter per la movimentazione delle ghiandole, e passare l'apertura della punta di più punte di 1000 microliter vicino a una fiamma per meno di un secondo per restringere le aperture. Quindi, ordinare le punte modificate da più strette a più larghe in base alla loro velocità di aspirazione. Per la dissezione della ghiandola accessoria, posizionare da 20 a 25 drosophila maschi in un piatto di vetro sul ghiaccio e utilizzare le forcep e un microscopio a dissezione per rimuovere il tratto riproduttivo di una mosca maschile.

Cancellare la coppia di ghiandole accessorie da tutti gli altri tessuti, compresi i teste e il bulbo eiaculatorio, e trasferire le ghiandole accessorie su una piastra di vetro contenente siero integrato a temperatura ambiente. Quando sono state raccolte 20 paia di ghiandole accessorie, lavare le ghiandole in un piatto di PBS per uno o due minuti a temperatura ambiente. Al termine del lavaggio, trasferire le ghiandole in una soluzione di dissociazione preparata al momento e utilizzare forcep affilati al microscopio sezionato per pizzicare saldamente il centro di un lobo ghiandolare.

Utilizzando una seconda coppia di forcep, tagliare il tessuto con la punta affilata per separare la regione prossimale della ghiandola accessoria e il condotto eiaculatorio dalla porzione della ghiandola contenente cellule secondarie. Quindi, utilizzare una punta di pipetta ampia e arrotondata a fiamma pre-bagnata di 200 microliter per trasferire le ghiandole in un tubo da 1,5 millilitri.