Drosophila Dissecção da glândula de acessório masculino: um método para isolar células secundárias

- Sob um microscópio de dissecção e em meios suplementados por soro, remova o trato reprodutivo de cada mosca com fórceps. Primeiro, remova partes do trato digestivo que possam ter acompanhado o trato reprodutivo. Para isolar as glândulas acessórias e o ducto ejaculatório, remova os testículos, a lâmpada ejaculatória e a terminalia.

Para expor as células dentro das glândulas à solução de dissociação, segure o centro de cada glândula com fórceps e corte através da glândula com um par de fórceps afiados. Remova a porção proximal da glândula e do ducto ejaculatório para deixar para trás a extremidade distal das glândulas contendo a rara população de células secundárias responsáveis pelo segregamento das proteínas envolvidas no acasalamento. Por fim, transfira as pontas da glândula acessório para um tubo de micro centrífugas em preparação para a digestão. No protocolo a seguir, dissecaremos as glândulas acessórias para isolar células secundárias para análise de transcriptome.

- Antes de iniciar o procedimento, corte e rodada de chama, amplas 200 dicas de microliter para manusear as glândulas, e passe a abertura da ponta de várias pontas 1000 microlitera perto de uma chama por menos de um segundo para estreitar as aberturas. Em seguida, classifique as pontas modificadas de mais estreitas para mais largas com base em sua velocidade de aspiração. Para dissecção de glândulas acessórias, coloque 20 a 25 drosophila macho em um prato de vidro no gelo e use fórceps e um microscópio de dissecção para remover o trato reprodutivo de uma mosca macho.

Limpe o par de glândulas acessórias de todos os outros tecidos, incluindo os testículos e a lâmpada ejaculatória, e transfira as glândulas acessórias para uma placa de vidro contendo soro suplementado médio à temperatura ambiente. Quando 20 pares de glândulas acessórios forem coletados, lave as glândulas em um prato de PBS por um a dois minutos à temperatura ambiente. No final da lavagem, transfira as glândulas para uma solução de dissociação recém-preparada, e use fórceps afiados sob um microscópio de dissecar para apertar firmemente o meio de um lobo gular.

Usando um segundo par de fórceps, corte o tecido com a ponta afiada para separar a região proximal da glândula acessório e o ducto ejaculatório da porção da glândula contendo células secundárias. Em seguida, use uma chama pré-molhada arredondada larga de 200 pontas de pipeta microliter para transferir as glândulas para um tubo de 1,5 mililitro.