Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Diseksiyon mikroskobu altında ve serum takviyeli medyada, üreme sistemini her sinekten forsepsle çıkarın. İlk olarak, sindirim sisteminin üreme sistemine eşlik etmiş olabilecek kısımlarını çıkarın. Aksesuar bezlerini ve boşalma kanalını izole etmek için testisleri, boşalma ampulünü ve terminali çıkarın. Serumu çıkarmak için PBS'de dokuyu bir ila iki dakika yıkayın.
Bezlerin içindeki hücreleri ayrışma çözeltisine maruz bırakmak için, her bezin merkezini forsepsle tutun ve bezi bir çift keskin forsepsle dilimleyin. Çiftleşmede rol oynayan proteinleri salgılamaktan sorumlu nadir ikincil hücre popülasyonunu içeren bezlerin distal ucunu geride bırakmak için bezin ve boşalma kanalının proksimal kısmını çıkarın. Son olarak, aksesuar bezi uçlarını sindirime hazırlık için bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Aşağıdaki protokolde, ikincil hücreleri transkriptom analizi için izole etmek için aksesuar bezlerini parçalara ayıracağız.
- İşleme başlamadan önce, bezleri işlemek için kesme ve alev yuvarlak, geniş 200 mikroliter uçları, ve açıklıkları daraltmak için bir alevin yakınında birden fazla 1000 mikroliter ucun uç açıklığına bir saniyeden daha az bir süre geçirin. Ardından, değiştirilen uçları aspirasyon hızlarına göre daha dardan daha geniş bir şekilde sıralayın. Aksesuar bezi diseksiyonu için, 20 ila 25 erkek drosophila'yı buz üzerindeki bir cam tabağa yerleştirin ve bir erkek sineğin üreme sistemini çıkarmak için forseps ve diseksiyon mikroskobu kullanın.
Aksesuar bezi çiftini testisler ve boşalma ampulü de dahil olmak üzere diğer tüm dokulardan temizleyin, ve aksesuar bezlerini oda sıcaklığında serum takviyeli ortam içeren bir cam tabağa aktarın. 20 çift aksesuar bezi toplandığında, bezleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika PBS kabında yıkayın. Yıkamanın sonunda bezleri taze hazırlanmış ayrışma çözeltisine aktarın ve glandüler lobun ortasını sıkıca sıkıştırmak için bir diseksiyon mikroskobu altında keskin forseps kullanın.
İkinci bir çift toparlama kullanarak, aksesuar bezinin proksimal bölgesini ve boşalma kanalını ikincil hücreleri içeren bezin kısmından ayırmak için keskin uçlu dokuyu kesin.
