Malpighian Tubule Dissektion fra en voksen Fly: Isolere en Osmoregulatory og Udskillelse Organ

- Begynd med en bedøvet voksen flyve i en dissekere parabol. Hold fluen ved brystkassen med pincet og åbne den bageste ende af maven ved hjælp af et andet par pincet. Da voksne fluer har to par malpighian tubules eller MTs, der konvergerer på tarmen gennem fælles urinledere, slæbebåd bagfra tarmen ud af fluen for at frigive MTs. Den bageste par MTs vil blive befriet først, da de omkranser bag tarmen. Fortsæt slæbe tarmen for at frigøre den forreste MTs og derefter klemme dem ud på ureter at adskille dem fra fluen.

For at montere tubules, skub en glasstang under ureter og overføre MTs til poly-L-lysin-belagt dias. Fastgør de dissekerede organer ved at trykke ureteren ned og derefter forsigtigt feje stangen over MTs. Poly-L-lysin på diaset vil fremme fastgørelse ved at øge antallet af positivt ladede steder til rådighed for negativt ladede celler i tubules at binde. I den følgende protokol, vil vi dissekere MTs fra en voksen kvindelig flyve og montere dem til ex vivo levende billeddannelse i et perfusionssystem.

- For at begynde denne procedure skal du placere to sæt loddehænder, der hjælper håndklemmer på billedmikroskopstadiet med en klemme på hver side. Næste, indsæt de respektive bøjede glaskapillærer i indstrømningslinjen og den vakuumforbundne udstrømningslinje.

Spred vakuumfedt på loftsbåndet og tryk klæbemiddel perfusion godt skillevæg på båndet for at belægge bunden med fedt. Skræl den klæbende perfusion godt skillevæg og læg den fedt side ned på toppen af en poly-L-lysin-belagt dias. Derefter skal du fjerne perfusionsbrønddeleren for at lade individuelle prøvebrønde spores i hydrofobisk fedt. Derefter placeres 200 mikroliter af stuetemperatur iPBS eller Insect Phosphat Buffered Saline i fedtet omgivet godt på den poly-L-lysinbelagte dias. Placer derefter diaset under stereoskopet, hæld iskold Schneiders medium i dissekereretten, og overføre en enkelt bedøvet kvinde flyve til det.

Hold fluen ved brystkassen med sættet af pincet og brug den anden til forsigtigt at gribe fat i den bageste mave. Træk den bageste ende af fluen i korte, bevidste bevægelser. Når bagindvolden er synlig, greb den distale ende og frigør tarmen og MTs fra de underliggende trachealer ved at trække bagindvolden væk fra kroppen gennem gentagne, korte slæbebåde.

Derefter klemmes de indvendige MT'er på ureteren med fine pincet, når det andet sæt MT'er er fri fra maven. Tag de frie forreste MT'er op med den trukket glasstang ved at skubbe stangen under urinrøret, så tubules falder til begge sider.

Sænk uret lige ned på rutsjebanen. Derefter anbringes rækkefølgen og forseglingen af MT'ernes distale linse ved yderligere at trykke ureteren på glasrutschebanen. Brug den fine ende af glasstangen til forsigtigt at feje hver tubule over diasoverfladen.

- Succes af denne teknik afhænger helt af nøjagtig identifikation og omhyggelig håndtering af de forreste malpighian tubules. Beskadigede tubules vil producere inkonsekvente resultater.

- Placer derefter klæbemidlet perfusionsbrøndens skillevæg tilbage på rutsjebanen for at danne en lille væskefyldt brønd over den monterede tubule. Læg derefter prøven på mikroskopstadiet.