Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begynn med en bedøvet voksen flue i en dissekeringsfat. Hold fluen ved thoraxen med tang og åpne den bakre enden av magen ved hjelp av et annet par tang. Siden voksne fluer har to par malpighian tubules eller MTs som konvergerer på tarmen gjennom vanlige urinere, slepe bak tarmen ut av flyet for å frigjøre MTs. Bakre par MTs vil bli frigjort først som de omkranser bak tarmen. Fortsett å tugging tarmen for å frigjøre fremre MTs og deretter klype dem av på urinlederen for å skille dem fra fluen.
For å montere tubuliene, skyv en glassstang under urinlederen og overfør MT-ene til poly-L-lysinbelagt lysbilde. Fest de dissekerte organene ved å trykke urinlederen ned og deretter forsiktig feie stangen over MTene. Poly-L-lysinen på lysbildet vil fremme vedlegg ved å øke antall positivt ladede steder som er tilgjengelige for de negativt ladede cellene i tubuliene å binde. I følgende protokoll vil vi dissekere MTs fra en voksen kvinnelig flue og montere dem for ex vivo live bildebehandling i et perfusjonssystem.
- For å starte denne prosedyren, plasser to sett med lodding som hjelper håndklemmer på bildemikroskopstadiet med en klemme på hver side. Deretter setter du inn de respektive bøyde glasskapillærene i innløpsledningen og den vakuumtilkoblede utstrømningslinjen. Deretter monterer du dem i de hjelpende hendene.
Spre vakuumfett på takbåndet og trykk den selvklebende perfusjonsbrønndeleren på båndet for å belegge bunnen med fett. Skrell av den selvklebende perfusjonsbrønndeleren og legg den fettsiden ned på toppen av en poly-L-lysinbelagt lysbilde. Deretter fjerner du perfusjonsbrønndeleren for å etterlate individuelle prøvebrønner sporet i hydrofobt fett. Deretter legger du 200 mikroliter romtemperatur iPBS eller insektfosfat bufret saltvann i fettet som er omkranset godt på den poly-L-lysinbelagte lysbildet. og overføre en enkelt bedøvet kvinne fly til den.
Hold fluen ved thoraxen med settet med tang og bruk den andre til å forsiktig gripe den bakre magen. Trekk den bakre enden av flyet kort, bevisste bevegelser. Når bakdraget er synlig, ta tak i den distale enden og frigjør tarmen og MT-ene fra de underliggende trakealene ved å trekke bakdraget bort fra kroppen gjennom repeterende, korte slepebåter.
Klem deretter av de indre MTene på urinlederen med fine tang når det andre settet med MTs er fri for magen. Plukk opp de frie fremre MTene med den trukket glassstangen ved å skyve stangen under urinlederen slik at tubuliene faller til hver side. Deretter løfter du MT-ene rett opp av løsningen. Deretter dreier du glassstangen slik at MTene og urinlederen festes til undersiden av stangen.
Senk urinlederen rett ned på lysbildet. Fest deretter rekkefølgen og forseglingen på de distale linsene på MT-ene ved å trykke urinlederen ytterligere på glassskuffen. Bruk den fine enden av glassstangen til forsiktig å feie hver tubule over glideflaten.
- Suksessen til denne teknikken avhenger helt av nøyaktig identifisering og forsiktig håndtering av de fremre malpighian tubuliene. Skadede tubuli vil gi inkonsekvente resultater.
- Plasser deretter den selvklebende perfusjonsbrønndeleren tilbake på gliden for å danne en liten væskefylt brønn over den monterte tubule. Deretter plasserer du prøven på mikroskopstadiet. Plasser henholdsvis innstrømnings- og utstrømningskapillærene over henholdsvis innløps- og utløpsåpningen til perfusjonsbrønnen.
