Malpighian Tubule Disección de una mosca adulta: Aislar un órgano osmoregulatorio y excretorio

- Comience con una mosca adulta anestesiada en un plato de disección. Sostenga la mosca junto al tórax con fórceps y abra el extremo posterior del abdomen usando un segundo par de fórceps. Dado que las moscas adultas tienen dos pares de túbulos malpighianos o MTs que convergen en el intestino a través de uréteres comunes, tiran del intestino trasero de la mosca para liberar a los MTs. El par posterior de MTs serán liberados primero mientras rodean detrás de la tripa.

Para montar los tubulos, deslice una varilla de vidrio debajo del uréter y transfiera los MTs a un tobogán recubierto de poli-L-lisina. Colocar los órganos diseccionados presionando el uréter hacia abajo y luego barrer cuidadosamente la varilla sobre los MTs. El poli-L-lisina en la diapositiva promoverá el apego aumentando el número de sitios cargados positivamente disponibles para que las células cargadas negativamente de los túbulos se unan.

- Para comenzar este procedimiento, coloque dos juegos de abrazaderas de las manos de soldadura en la etapa del microscopio de imágenes con una abrazadera a cada lado.

Extienda la grasa de vacío sobre la cinta del techo y presione el divisor del pozo de perfusión adhesiva en la cinta para recubrir la parte inferior con grasa. Después de eso, retire el divisor del pozo de perfusión para dejar pozos de muestras individuales rastreados en grasa hidrofóbica. Después de eso, coloque 200 microlitros de iPBS a temperatura ambiente o línea salina amortiguada de fosfato de insectos en la grasa rodeada bien en el tobogán recubierto de poli-L-lisina. y transferir una sola mosca hembra anestesiada a ella.

Sostenga la mosca junto al tórax con el conjunto de fórceps y utilice el otro para agarrar suavemente el abdomen posterior. Tire del extremo posterior de la mosca en movimientos cortos y deliberados. Una vez que el intestino trasero sea visible, agarre el extremo distal y libere el intestino y los MTs de los tráqueos subyacentes tirando del intestino trasero lejos del cuerpo a través de remolcadores repetitivos y breves.

A continuación, pellizque los MTs interiores en el uréter con fórceps finos una vez que el segundo juego de MTs esté libre del abdomen.

Baje el uréter directamente hacia abajo en la diapositiva. Utilice el extremo fino de la varilla de vidrio para barrer suavemente cada tubérculo a través de la superficie del tobogán. Ortolice la varilla contra el tobogán para evitar aplastar el tubérculo y deslice la varilla sobre la parte superior del tubérculo, moviéndose de distal a proximal para fijar toda la longitud de cada tubérculo a la superficie del tobogán recubierto de poli-L-lisina.

- El éxito de esta técnica depende enteramente de la identificación precisa y el manejo cuidadoso de los túbulos malpighianos anteriores.

- A continuación, coloque el divisor del pozo de perfusión adhesivo en el tobogán para formar un pequeño pozo lleno de líquido sobre el tubérculo montado.