Yetişkin Bir Sinekten Malpighian Tübüle Diseksiyonu: Osmoregulatory ve Boşaltım Organlarını İzolasyon

- Bir diseksiyon kabında uyuşturulduğu yetişkin bir sinekle başlayın. Sineği toraksın yanından tokapsla tutun ve ikinci bir çift asa kullanarak karnın arka ucunu açın. Yetişkin sineklerin ortak üreterler aracılığıyla bağırsaklara yakınsayan iki çift malpighian tübülleri veya MT'leri olduğundan, MTs'yi serbest bırakmak için arka bağırsağı sinekten çekin. Arkadaki MTs çifti, bağırsakların arkasına çevrelerken önce serbest bırakılacaktır. Ön MR'ları serbest bırakmak için bağırsakları çekmeye devam edin ve sonra onları sinekten ayırmak için üreterde kıstırın.

Tübülleri monte etmek için üreterin altına bir cam çubuk kaydırın ve MT'leri poli-L-lizin kaplı slayda aktarın. Parçalanan organları üretere bastırarak yapıştırın ve ardından çubuğu MT'lerin üzerine dikkatlice süpürün. Slayttaki poli-L-lizin, tübüllerin negatif yüklü hücrelerinin bağlanması için mevcut pozitif yüklü bölgelerin sayısını artırarak bağlanmayı teşvik edecektir. Aşağıdaki protokolde, MTs'yi yetişkin bir dişi sinekten parçalara ayıracağız ve bir perfüzyon sistemine ek vivo canlı görüntüleme için monte edeceğiz.

- Bu prosedüre başlamak için, iki lehimleme setini görüntüleme mikroskop aşamasına her iki tarafta bir kelepçe ile yerleştirin. Daha sonra, ilgili bükülmüş cam kılcal damarları giriş çizgisine ve vakumla bağlanmış çıkış hattına yerleştirin. Sonra bunları yardım eden ellere monte edin.

Vakum gresini tavan bandına yayın ve tabanı gresle kaplamak için yapışkan perfüzyon kuyusu bölücüyü bandın üzerine bastırın. Yapışkan perfüzyon kuyusu bölücüyü soyun ve yağ tarafını poli-L-lizin kaplı bir kaydırağın üzerine yerleştirin. Bundan sonra, hidrofobik greste izlenen bireysel numune kuyularını bırakmak için perfüzyon kuyusu bölücüyü çıkarın. Bundan sonra, poli-L-lizin kaplı slaytta iyice çevrelenmiş grese 200 mikrolitre oda sıcaklığında iPBS veya Böcek Fosfat Tamponlu Salin yerleştirin. ve ona tek bir uyuşturularak dişi sinek aktarın.

Sineği torakstan, ön ayak takımıyla tutun ve arka karnı hafifçe kavramak için diğerini kullanın. Sineğin arka ucunu kısa, kasıtlı hareketlerle açın. Arka bağırsak görünür olduğunda, distal ucu tutun ve arka bağırsağı tekrarlayan, kısa römorkörlerle vücuttan çekerek bağırsakları ve MT'leri alttaki trakeallerden kurtarın.

Daha sonra ikinci MTs seti karından arındırılmış olduğunda, üretterdeki iç MTs'leri ince kanatlarla kıstırın. Çubuğu üreterin altına kaydırarak çekilen cam çubukla serbest ön MT'leri alın, böylece tübüller her iki tarafa da düşer. Bundan sonra, MT'leri doğrudan çözeltiden kaldırın. Bundan sonra, cam çubuğu, MTs ve üreterin çubuğun alt tarafına yapışacak şekilde çevirin.

Üreteri doğrudan slayda küçümseyin. Her boruyu slayt yüzeyine hafifçe süpürmek için cam çubuğun ince ucsunu kullanın. Borunun ezilmemesi için çubuğu kaydırağa doğru destekleyin ve çubuğu borunun üstüne kaydırın, distalden proksimale geçerek her borunun tüm uzunluğunu poli-L-lizin kaplı slaytın yüzeyine tutturun.

- Bu tekniğin başarısı tamamen ön malpighian tübüllerinin doğru tanımlanmasına ve dikkatli bir şekilde işlenmesine bağlıdır. Hasarlı tübüller tutarsız sonuçlar üretecektir.

- Daha sonra, yapışkan perfüzyon kuyusu bölücüyü, monte edilen tübül üzerinde küçük bir sıvı dolu kuyu oluşturmak için kaydırağa geri yerleştirin. Bundan sonra, numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. Giriş ve çıkış kılcal damarlarını sırasıyla perfüzyon kuyusunun giriş ve çıkış açıklığı üzerine yerleştirin.