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Encyclopedia of Experiments: Biology

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Montage von Adult Drosophila Brains

 
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Montage von Adult Drosophila Brains: Eine Methode zur Vorbereitung von Dias für konfokale Bildgebung

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- Auf einem positiv geladenen Mikroskopschlitten, halten Sie zwei Abdeckungsscheine mit genügend Abstand zwischen ihnen, um einen Raum für die Drosophila Gehirne montiert werden. Unter dem Stereo-Mikroskop, Pipette die Gehirne in Montagemedium in diesen Raum. Die negative Ladung des Gewebes wird den Gehirnen helfen, die positive Ladung auf der Oberfläche des Dias zu haften.

Entfernen Sie überschüssiges Montagemedium, um eine präzise Positionierung der Gehirne auf dem Dia in einem Rastermuster mit den Antennenlappen nach oben zu ermöglichen, und überbrücken Sie dann die beiden Abdeckungsrutschen, indem Sie einen dritten Deckelschlupf querhalten, um das Gehirn zu bedecken.

Um den Hohlraum zu füllen, legen Sie das Montagemedium einen Tropfen nach dem anderen in den Rand des Hohlraums, und lassen Sie ihn durch Kapillarbewegung ausbreiten, damit es das Gehirn nicht stört.

Versiegeln Sie den Hohlraum mit Nagellack und lagern Sie bei negativen 20 Grad Celsius im Dunkeln, um die Fluoreszenz von gebeizten Geweben zu erhalten.

Im Beispielprotokoll werden wir Drosophila-Gehirne für die konfokale Bildgebung immunobestainierter Neuronen montieren.

- Um die Gehirne zu montieren, bauen Sie eine Brückenrutsche. Position zwei Basisabdeckungen rutscht etwa einen Zentimeter auseinander auf einem positiv geladenen Schlitten. Stellen Sie sicher, dass die positiv geladene Seite nach oben ist. Dann die Abdeckung rutscht auf die Rutsche mit Fingernagelpolitur, und lassen Sie die Politur vollständig trocknen, bevor Sie fortfahren.

Als nächstes legen Sie das Dia unter einem Stereomikroskop und Pipettengehirne in Medium in den Raum zwischen den Abdeckungsrutschen. Achten Sie darauf, die Beleuchtung anzupassen, um die Visualisierung der Gehirne zu verbessern.

Als nächstes saugen Sie die zusätzlichen Montagemedien aus der Rutsche, vorsichtig, um die Gehirne zu vermeiden. Dann leiten Sie restliche überschüssige Montagemedien ab. So können die Gehirne genauer positioniert werden. Nun, mit Zangen, orientieren Sie die Gehirne in ein Rastermuster mit ihren Antennenlappen nach oben.

Legen Sie dann einen Deckelschlupf über das Gehirn, und verwenden Sie Fingernagellack, um die Ränder des oberen Deckelschlupfzu zu versiegeln, die an den Basisabdeckungsscheinen befestigt sind.

Laden Sie nun die Mittelhöhle tropfenweise mit frischen Montagemedien, so dass die Medien durch Kapillarwirkung unter den Deckelgezogen werden können. Wenn der Hohlraum gefüllt ist, versiegeln Sie ihn vollständig mit klarem Fingernagellack.

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