Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- ראשית, זחלי דרוזופילה אימונוסטיין עם סמנים המדגישים היבטים שונים של NMJs או צמתים נוירומוסקולריים.
האקסון מסתיים במספר ענפים היוצרים בליטות הנקראות בוטונים. נוירוטרנסמיטורים משתחררים מבוטונים וגורמים להתכווצות שרירים. אזורים של שחרור נוירוטרנסמיטר נקראים אזורים פעילים.
לאחר מכן, רכוש תמונות NMJ באמצעות מיקרוסקופיה והערכה כמותית של המורפולוגיה שלהן באמצעות תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית למחצה. החל סדרה מוגדרת מראש של פקודות תוכנה על התמונות. קבצי הפלט מכילים תמונות NMJ ותוצאות מורפולוגיה מנותחות.
בדוגמה הבאה, ננתח את המורפולוגיה של Drosophila NMJs מוכתם DLG1, סמן postsynaptic, ו BRP, סמן אזור פעיל.
- עבור פרוטוקול זה, ליצור ערימות תמונה של NMJs ולשמור אותם כקבצי TIFF בודדים שבו ערוץ 1 מראה כתמי DLG1 או סמן דומה ערוץ 2 מראה כתמי BRP. כדי להתחיל, ליצור Z תחזיות hyperstacks של קבצי תמונה NMJ. פתח את אפשרויות התוסף ובחר Drosophila NMJ morphometrics.
עכשיו, לזהות את מחרוזת הקובץ הייחודית כי המיקרוסקופ הקצה לסדרת התמונות בעת אחסון אותם כמו TIFF. זה יהיה בסוף שם התמונה. העתק והדבק את המחרוזת שניתנה למישור הנמוך ביותר ומספר ערוץ לתוך חלון הגדרת מחרוזת הקובץ הייחודי.
עבור כל קובץ תמונה, שני קבצים חדשים נוצרים עם מחסנית שמות ברירת המחדל ומחסנית שטוחה, ואחריו שם התמונה המקורי. לאחר מכן ניתן למחוק את הקבצים המקוריים כדי לחסוך בשטח אחסון.
עם פתיחת ההקרנה הראשונה, בחר את כלי הבחירות ביד חופשית ולאחר מכן השתמש בעכבר כדי להגדיר אזור המכיל מסוף NMJ שלם של עניין. לאחר שנבחר, לחץ על אישור בחלון המסוף המוגדר.
כדי לכמת את התכונות של NMJ, עבור תחילה לממשק המורופומטרי Drosophila NMJ והגדר את קנה המידה. לדוגמה, אם פיקסל אחד של התמונה תואם ל- 0.72 מיקרון, הגדר פיקסלים לקנה מידה ל- 1 והרחב את המרחק ל- 0.072. לאחר מכן בחר את תת-המאקרו Analyze, ואם קיימות שתי תמונות ערוצים, החלף מצב גם המתן.
לאחר הניתוח, קבצי תמונה חדשים עבור כל סינפסה מנותחת מאוחסנים בתיקיית ההורים, והמדידות הכמותיות נמצאות בקובץ .txt התוצאות.
לדוגמה, ייתכן שחלקים מהמסוף הסינפטי לא ייכללו בחלוקה לרמות הצהובה. ייתכן שחלקים מהרקע ייכללו במסוף הסינפטי. קו שלד כחול עשוי להתרחב מעבר למסוף הסינפטי.
